EST sequence analysis: e agora?

Um projeto de transcriptoma começa tradicionalmente com a geração de bibliotecas de cDNA, como já discuti extensivamente por aqui. Agora que superei esta etapa, começa o que para mim é um desafio um pouco maior: a análise das seqüências obtidas. Um desafio por que (1) eu nunca fiz isso antes (2) por que por mais que se leia livros, artigos e tutoriais dos softwares, isso só se aprende mesmo com a prática e (3) por que são centenas de sequencias e por tanto uma grande quantidade de dados são gerados. Este último fator é um "problema" crescente na biologia. Com técnicas cada vez mais modernas e rápidas, uma grande quantidade de dados tem sido gerada e para lidar com eles, ou seja, para extrair informação deles, somente os bioinformatas podem nos ajudar! E de fato, o tem feito. Tanto, que uma das minhas dificuldades tem sido: que programa usar? E a resposta esta geralmente associada a "free download", uma vez que os bioinformatas sabem valorizar bem seu trabalho. No entanto, não é fácil para os "não-bioinformatas" aprenderem a usar os vários softwares de que precisam de forma crítica, entendendo de fato o que estão fazendo, o que significa cada parâmetro dentro do processo em questão e não apenas reproduzindo uma série de comandos pré-estabelecidos por alguém.

Embora eu não tenha experiência com isso, sempre tive interesse e se aparecer qualquer curso , disciplina ou conversa fiada sobre o assunto, eu estou dentro! No entanto, estou conformada com a idéia de que vou ter que ser um pouco autodidata para aprender tudo isso, como muitas vezes temos que ser na vida acadêmica, o que não é realmente um problema. Assim, após um jejum de posts, resolvi escrever este, mais uma vez, para me ajudar a ordernar minhas idéias.

Bom, os dados que eu tenho em mãos são um grupo de sequências obtidas de clones selecionados aleatoriamente das bibliotecas de cDNA. Estas sequencias foram obtidas através de reações de sequenciamento a partir de amostras de DNA plasmidial usando um primer universal específico para o plasmidio no qual as bibliotecas foram construídas. E como resultado, tem-se um grupo de (na ordem de centenas) sequencias de nucleotídeos e os respectivos cromatogramas, mostrando o sinal para cada base.

Como saber o que estas sequencias significam? Que genes codificam? Em que processos estão envolvidos? Todas as sequências são de genes diferentes? Existem sequencias de regiões diferentes de um mesmo gene? Qual a redundância das sequências? Qual padrão de códons usado pelo organismo? É possível identificar microsatélites, SNPs ou outros polimorfismos?

Todas estas perguntas somente podem ser respondidas através de ferramentas computacionais! E, por isso, ao invés de ter medo desses programas, temos mais é que agradecer que eles existem! E com isso em mente, respirar fundo e aprender a usá-los, pois eles estão aí para nos ajudar.

No próximo post, vou descrever as principais etapas do processo de análise e identificação de EST (Expressed Sequence Tags) geradas a partir de bibliotecas de cDNA. Até lá!

Clonagem III: e as bibliotecas?

Esclarecidos alguns pontos no post anterior...a dificuldade da clonagem de bibliotecas de cDNA é que se tem em mãos uma mistura complexa com seqüências de diferentes tamanhos...o que torna impossível saber ao certo a razão molar e calcular o quanto se deve adicionar de insertos. O jeito é ir tentando diferentes quantidades. Outra questão é que quanto menor o fragmento, mais eficientemente ele será clonado! Uma grande pedra no sapato quando se quer construir bibliotecas full lenght com fragmentos maiores que 1 kb. Por isso, é importante adicionar algumas etapas para remover do cDNA os fragmentos de menor tamanho, como já discuti aqui antes. Aliás, tudo favorece os fragmentos pequenos: PCR, ligação por T4 DNA ligase e a transformação de fragmentos pequenos são sempre mais eficientes e podem introduzir bias e reduzir a freqüência de fragmentos maiores.

Quando clonando apenas um gene específico, obtendo-se 20% de recombinantes, já é o suficiente: pegando 10 colônias, em pelo menos duas, você encontrará o seu clone! Mas, em uma biblioteca de qualidade, espera-se pelo menos 90% de clones recombinantes. Caso contrário, não vale a pena prosseguir com um “random sequencing”, ou seja, pegar 1000 clones, extrair o plasmídio e seqüenciar para achar apenas 200 sequencias que ainda por cima podem ser repetidas...é jogar dinheiro fora! Por isso, todo este sistema deve ser otimizado para estar funcionando muitíssimo bem: as enzimas de restrição, as etapas de purificação, a remoção de fragmentos pequenos, reação de ligação e transformação! Aliás, me convenci de vez: bibliotecas só transformando por eletroporação! Tentei transformar por choque térmico usando células “super”competentes comerciais, especiais para bibliotecas e para fragmentos grandes, etc...o controle, pUC18, plasmidio pequenininho, funcionou super bem, na ordem de 10(9), mas para as bibliotecas, não. O máximo que consegui foi na ordem de 10(4). Com a eletroporação, consegui um aumento de duas ordens de grandeza 10(6), sendo que não usei toda a minha reação de ligação.

Bom, isso tudo não é o fim do mundo, não é impossível – eu tenho 1 bilhão de papers no meu computador - só é mais difícil...mas a gente chega lá! :-)

Bom, mesmo eu tendo tratado o assunto clonagem meio superficialmente, ficou muitíssimo longo e chato, praticamente, um desabafo! Se você chegou até aqui ou é muito meu amigo ou provavelmente tem um interesse maior no assunto e recomendo a leitura deste capítulo de livro:

“Recombinant DNA technology and molecular cloning”
Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison
Outros dois capitulos deste livro estao disponiveis no link:
http://www.blackwellpublishing.com/allison/contents.htm

Apesar de ser um pouco básico é bem completo (e longo!).

Vivendo (lendo) e aprendendo

Hoje eu li duas coisas, digamos, interessantes, que podem explicar nossos resultados com a ultima biblioteca.

1. Parece que o plasmidio da clontech que, supostamente, é fornecido digerido e fosforilado e pronto para clonagem nao é tao fosforilado assim. Eu nunca me senti confortàvel com isso. Sempre achei que se deve ter um estoque de plasmidio circular (para amplificar mais quando necessario) e EU MESMA digeri-lo e desfosforilà-lo para logo em seguida realizar a reaçao de ligaçao e assim evitar que o plasmidio circularize (sem inserto) antes ou durante a clonagem.

2. Durante o screening inicial da biblioteca, por meio de PCR de colonias, quando nao hà inserto no plasmidio, sao geradas bandas de aproximadamente 500 pb, especificamente com os primers e plasmidio que usei. Advinha qual era o tamanho da banda da maior parte dos clones que eu analisei??? Sim, isso mesmo! Aproximadamente 500 pb!

Mas, tudo bem. Este é o melhor momento para eu descobrir estas coisas. E viva as pessoas que publicam suas experiencias na internet, pois obviamente nenhuma destas informaçoes estava no manual do kit!

Obs: desculpem os erros, teclado italiano.

Normalização de cDNA

Volto às bibliotecas de cDNA, mas agora para falar sobre o método de normalização que comentei no penúltimo post. Como eu havia dito, as grandes diferenças nos níveis de expressão dos genes e, logo, nos níveis de RNAm, dificultam o isolamento de genes pouco expressos através da análise dos clones de uma biblioteca de cDNA. Em uma biblioteca de cDNA normalizada, os diferentes cDNAs estão presentes, mais ou menos, na mesma proporção. Mas como normalizar uma biblioteca?

Os principais métodos de normalização de bibliotecas se baseiam em um princípio da cinética de reassociação do DNA. Durante o processo de reassociação do cDNA, após desnaturação (separação da dupla fita), as seqüências presentes em maior número irão se reassociar mais rapidamente do que as presentes em um menor número de cópias. Como conseqüência, primeiramente formam-se duas frações: uma fração de cDNA reassociado (ds cDNA, dupla fita) constituída pelas seqüências mais freqüentes e outra de cDNA fita simples (ss cDNA) constituída pelas seqüências mais raras (mas que também contém algumas cópias das seqüências mais freqüentes).

[Dedução minha] Isto acontece por uma questão de probabilidade. Tem-se uma mistura de cDNA complexa com milhares de cDNAs diferentes. Elevando-se a temperatura, o cDNA é desnaturado: as pontes de hidrogênio que mantém as duas fitas unidas são rompidas. Reduzindo novamente a temperatura, o cDNA se reassocia: as moléculas fitas simples se hibridizam com as respectivas fitas simples complementares a elas, voltando a forma dupla fita. A probabilidade de isto acontecer (as duas fitas simples complementares se reassociarem) é proporcional à concentração das mesmas na mistura: quanto maior a concentração, maior a probabilidade de uma fita encontrar a outra complementar na mistura.

Portanto, durante a renaturação do cDNA, as seqüências mais abundantes formam uma fração dupla fita e as menos freqüentes, uma fração fita simples. Esta última é a fração normalizada, onde os diferentes genes estão presentes mais ou menos em igual número. Os métodos de normalização existentes se diferenciam na forma de separação de uma fração da outra. Para não me estender ainda mais, não vou explicar os outros métodos, mas em geral todos possuem muitas etapas, exigem muito tempo e trabalho e não são adequados para a normalização de seqüências de cDNA completas. Como eu sou preguiçosa, procurei um mais fácil! hehehe Na verdade, foi um dos primeiros métodos de normalização sobre o qual li, então, eu dei sorte mesmo :)

O método de normalização em questão se chama “DSN (duplex-specific nuclease) normalization” e foi desenvolvido por um grupo de Moscou, Rússia (Zhulidov et al, 2005). Para isolar a fração normalizada fita simples, eles utilizam uma enzima chamada DSN (purificadas por eles a partir do garanguejo Paralithodes camtschatica). Esta enzima, como o nome já diz, é uma nuclease que cliva especificamente DNA dupla fita (tanto o duplex DNA-DNA quanto DNA-RNA, o que possibilita proceder a normalização já no produto da reação de síntese da primeira fita de cDNA). Como a DSN é termoestável e funciona a 70ºC, é possível utilizá-la para degradar a fração fita dupla na temperatura em que ocorre a renaturação do DNA. A temperatura de 70ºC também tem a vantagem de evitar que hibridizações não específicas ocorram e que transcritos sejam perdidos devido à formação de estruturas secundárias (que também seriam clivadas pela enzima). A fração fita simples remanescente é então amplificada por PCR. Na gelzinho a baixo, é possível observar o resultado da normalização. Na primeira raia do gel, foi aplicado um padrão, na segunda, o cDNA antes da normalização (com bandas nitidamente mais fortes, referentes a genes altamente expressos) e na terceira, o cDNA após o tratamento com a enzima DSN, onde não se observam mais as bandas existentes anteriormente. Muito bonitinho.

Mas, como nem tudo é perfeito, na etapa de amplificação do ss cDNA, há um segundo problema. Em uma mistura complexa de cDNA, com fragmentos de tamanhos muito distintos, os menores fragmentos serão amplificados mais eficientemente que os maiores pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Isto significa que a amplificação do cDNA, anterior a sua clonagem em um vetor, resulta na perda das seqüências raras e mais longas, assim como na redução do comprimento médio dos insertos da biblioteca.

Para resolver isso, eles lançaram mão de um método chamado Regulation of Average Length of PCR Product (Regulação do comprimento médio do produto da PCR) desenvolvido por eles anteriormente (Shagin et al 1999). Seguindo-se esta abordagem, o cDNA fita simples é amplificado por PCR utilizando apenas um primer (“single primer PCR”), o mesmo primer funciona como foward e reverse. Como resultado, após um 1 ciclo, a molécula de DNA gerada desta forma contém terminações invertidas e, portanto, complementares (ITRs - inverted terminal repeats) referentes ao primer. No próximo ciclo do PCR, quando as moléculas de cDNA molde forem desnaturadas, as terminações invertidas de uma molécula fita simples tendem a hibridizar uma com a outra, competindo com os primers e inibindo, portanto, a amplificação. Este anelamento entre as terminações da molécula e, portanto, a inibição da amplificação pela polimerase serão maiores nos fragmentos menores, pois nestes, a probabilidade de uma extremidade encontrar a outra é bem maior que em fragmentos maiores, como observado na figura abaixo. Logo, este protocolo permite inibir a amplificação de fragmentos pequenos, favorecendo a amplificação das seqüências completas.

Concluindo, na abordagem proposta por Zhulidov e seus colegas, são combinadas três abordagens para construir uma biblioteca de cDNA normalizada (baixa redundância) e enriquecida com seqüências completas: 1) A tecnologia SMART que otimiza a síntese e amplificação de seqüências completas na reação de síntese da 1ª fita e na sua amplificação (que já usamos no lab e que não expliquei aqui) 2) A normalização do cDNA pela DSN e 3) A regulação do comprimento médio do produto da PCR durante a amplificação da fração normalizada. Pelo que vi até agora, acho que é a melhor forma de se construir uma biblioteca de cDNA normalizada.

No entanto, no curso de ecotoxicogenômica do ECOTOX, os gringos passaram voando por um slide que falava sobre este método e resolvi perguntar depois se era “isso tudo mesmo”. Eles disseram que funciona bem e que não é difícil de fazer, mas que quando se faz um pool das colônias transformantes para amplificação da biblioteca e posterior estoque, a normalização é perdida, pois os clones (de bactéria) crescem em velocidades diferentes e, no final das contas, estarão presentes em proporções diferentes. Se for assim mesmo, isto significa que, após a transformação, seria necessário analisar o maior número de colônias possíveis ou estocar as colônias isoladamente (crescê-las em placas de 96 ou 384 poços, adicionar glicerol e congelá-las).

Bibliotecas de cDNA

A princípio, eu estava pensando em escrever aqui um pouco sobre a construção de bibliotecas de cDNA normalizadas, em particular, sobre uma abordagem de normalização desenvolvida recentemente que achei m-u-i-to elegante (que espero poder usar!).Mas, resolvi que seria melhor começar pelo básico e, assim, colocar todas as idéias em ordem.

Bom, para começo de conversa, o que é e para que serve uma biblioteca de cDNA?

Uma biblioteca de cDNA (ou de expressão) é uma coleção das seqüências expressas em um tecido ou tipo celular de um organismo, em um dado momento. Estas seqüências são representadas pelo pool de cDNA (DNA complementar) obtido através da enzima transcriptase reversa a partir do pool de RNA mensageiro isolado a partir das células ou tecido em questão. Estas seqüências de cDNA são, então, clonadas em um plasmídio ou, menos freqüentemente, também em outros tipos de vetores de clonagem como fagos, cosmids e phagemids. Portanto, uma biblioteca de cDNA é um conjunto de seqüências expressas isoladas em um vetor de clonagem, onde podem ser armazenadas de forma estável e por longos períodos e a partir do qual podem ser prontamente seqüenciadas através de primers universais.

Tipos celulares diferentes expressam genes diferentes, em intensidades diferentes e até um mesmo tipo celular pode apresentar diferentes perfis de expressão gênica ao longo do desenvolvimento e em função de variáveis ambientais. Por exemplo, uma biblioteca de cDNA construída a partir de RNA isolado de um neurônio irá conter um conjunto de seqüências distintas de uma biblioteca construída a partir de RNA de um fibroblasto.

Assim como, uma biblioteca de cDNA do fígado de um camundongo que se alimenta com dieta só de gorduras, não será igual a de um com dieta normal, contendo quantidades adequadas de lipídeos, caboridratos, proteínas...

Portanto, é preciso considerar a partir de qual, ou quais, tecidos ou células se vai construir a biblioteca de expressão, assim como as condições ambientais e estágio do desenvolvimento do organismo estudado. Embora, obviamente, existam genes que são expressos sempre e em todas as células de um organismo, se o objetivo é isolar as seqüências expressas relacionadas a um processo particular que só ocorre em um tecido específico, não há por que utilizar outro tecido como fonte de RNA.

Uma série de processos biológicos pode ser estudada através da análise da expressão gênica. Atualmente, pode-se avaliar quantitativamente os níveis de um RNA mensageiro específico assim como é possível avaliar a sua localização espacial e temporal no organismo, em um tecido ou mesmo em uma única célula. Para a viabilização destes estudos, a seqüência do RNAm de interesse deve ser conhecida e a construção de uma biblioteca de cDNA possibilita a prospecção de seqüências gênicas expressas de interesse através de algumas abordagens de triagem, como por exemplo, o PCR de colônia com primers degenerados (desenhados a partir de domínios conservados no gene de interesse).

No entanto, bibliotecas de cDNA não são construídas somente com o objetivo de isolar uma ou algumas seqüências gênicas relacionados a um processo específico ou para isolar genes que são diferencialmente expressos em função de uma condição de estudo, como no caso das bibliotecas de cDNA subtrativas (sobre as quais não vou falar aqui). O isolamento e sequenciamento, em grande escala, de clones de cDNA a partir de bibliotecas de expressão tem se tornado uma boa alternativa para o sequenciamento do DNA genômico na identificação de novas seqüências gênicas. São necessários menos recursos e a estrutura dos genes é prontamente identificada, ao contrário das seqüências genômicas que em eucariotos são interrompidas por íntrons, sendo necessário lançar mão de ferramentas de bioinformática para tentar prever a estrutura do gene e a seqüência expressa. Além disso, em uma biblioteca de DNA genômico, a maior parte dos clones não contém seqüências gênicas, sendo o isolamento destas, muito mais trabalhoso.

A caracterização em grande escala das seqüências de cDNA abre espaço para uma nova abordagem, a genômica funcional, que busca elucidar a função dos genes em uma escala genômica. Uma das principais abordagens se baseia na avaliação e comparação, em diferentes condições, dos perfis de expressão gênica, ou seja, do transcriptoma – todo o conjunto de RNAm expresso em um organismo, tecido ou célula em um determinado contexto. O estudo de transcriptomas têm sido feito principalmente por meio dos DNA arrays, ou microarranjos de DNA. Através desta tecnologia, é possível monitorar até mesmo a expressão de todos os genes de um organismo, como já foi feito para a levedura S. cerevisiae que teve seus aproximadamente 6000 genes impressos em um chip possibilitando a avaliação das alterações globais no perfil de expressão gênica em função de várias condições, como estresse oxidativo. Mas, o microarranjo de DNA e suas aplicações são assuntos para textos futuros.

Um biblioteca de cDNA de qualidade, que possibilite o isolamento de virtualmente todas as seqüências expressas no objeto de estudo, deve preencher alguns requisitos:

1) Deve ser representativa, ou seja, apresentar pelo menos uma cópia de cada RNA mensageiro expresso no tecido ou célula de onde se isolou o RNAm.

2) Deve conter seqüências completas, para que se possa fazer uma avaliação funcional da biblioteca (através da comparação das seqüências obtidas com outras já descritas depositadas nos principais bancos de dados públicos) e para se ter acesso a toda a seqüência de aminoácidos da proteína codificada.

3) Deve ter o mínimo possível de redundância (muitos clones contendo um mesmo gene), facilitando o isolamento de um maior número de seqüências distintas.

4) Deve ter o maior número possível de clones recombinantes (plasmídios contendo inserto de cDNA).

As pedras no caminho...

Estas são as características da biblioteca de cDNA dos meus sonhos! Mas, não é tão simples assim construir uma biblioteca de cDNA de qualidade. Existem várias pedras no caminho, começando pela instabilidade do RNA, constantemente sujeito a degradação por RNAses, como já falei exaustivamente por aqui, oque dificulta o isolamento de seqüências completas. Além disso, durante a retrotranscrição e amplificação do cDNA pode ocorrer a amplificação incompleta dos fragmentos e o PCR tem a tendência de amplificar seqüências curtas mais eficientemente que as longas, sendo muitas seqüências completas "perdidas" neste processo. A proporção de clones recombinantes depende da eficiência da reação de clonagem, da seleção dos clones recombinantes e de uma série de outros fatores...

Mas, o principal problema, ao meu ver, diz respeito à representatividade e, principalmente, a redundância da biblioteca. Em uma célula eucariótica típica, o RNA mensageiro representa apenas 1-5% da massa de RNA total. O número de cópias de mRNA por gene varia absurdamente. Em geral, existem três classes de nível de expressão: 1) 5-10 genes housekeeping que são altamente expressos e representam até 20% do total de RNA mensageiro; 2) 500-2000 genes que têm um nível de expressão intermediário e representam 40-60% do total de mRNA da célula; 3)10000-20000 genes que são expressos moderadamente e representam 20-40% do total de mRNA da célula.

Logo, a maior parte dos genes são expressos em níveis moderados (até apenas 1 molécula de RNAm por célula!). Isto significa que uma biblioteca de cDNA construída a partir de um pool de RNAm típico de células eucarióticas deveria apresentar uma elevada redundância (alguns poucos genes presentes em alta freqüência) e baixa representatividade. Para se ter noção das implicações disso, para se isolar um clone cuja freqüência seja 1:10000 seria necessário seqüenciar até 100000 clones! Haja dinheiro, tempo, disposição, extensão do prazo de conclusão da dissertação, etc...

Isto não é um problema se o seu objetivo é isolar o cDNA de uma actina, por exemplo, que certamente se encaixa na primeira classe de genes. Mas é um grande problema para quem quer isolar e seqüenciar um grande número de cDNA diferentes, inclusive os de expressão intermediária e baixa, para disponibilizar as seqüências expressas em organismos cujos genomas são praticamente desconhecidos.

Este era o ponto onde queria chegar para começar a falar da abordagem de normalização de cDNA que comentei no início do texto, que na verdade é uma combinação de técnicas que visam a construção de uma biblioteca de cDNA com seqüências completas, representativa e de baixa redundância. Ou seja, que chuta todas estas pedras no caminho para bem longe! Ao menos, assim espero! No próximo post, escreverei sobre isso. Arrivederci!