SHORT TIPS - Quando enzimas de restrição cortam onde não devem

Laboratório de biologia molecular que se preze tem pelo menos meia dúzia de enzimas de restrição no freezer. Elas cortam o DNA, não em pontos aleatórios, mas em sequências específicas, os sítios de restrição. Um grande número destas enzimas já foi identificado e está disponível comercialmente. Cada uma delas reconhece e corta um sítio de restrição diferente. E é justamente por isso que elas são tão úteis. Não importa qual seja a sua aplicação - cortar um plasmídio e/ou gene para clonagem ou a análise do padrão de fragmentos de um genoma – a especificidade destas enzimas é sempre essencial para o sucesso do experimento.

Mas, como nem tudo é perfeito, em algumas condições estas enzimas podem cortar o DNA onde não devem, ou seja, em sequências diferentes do seu sítio de restrição. O nome deste fenômeno é “atividade estrela” (star activity) e acontece quando a reação de digestão do DNA não segue as condições consideradas ótimas para o funcionamento da enzima. Em geral, você estará seguro se seguir o protocolo do fabricante, mas veja abaixo alguns cuidados para evitar este problema, principalmente, ao modificar o volume de reação.

Quantidade de enzima por reação.

Não deve ultrapassar 10% do volume final da reação. A enzima vem em uma solução que contem 50% de glicerol. E mais de 5% de glicerol na reação irá causar atividade estrela. Também é importante respeitar a quantidade de enzima (unidades) por quantidade (ug) de DNA recomendada pelo fabricante.

Tampão.

Use sempre o tampão recomendado, na diluição indicada. Em geral, cada enzima tem um tampão ótimo. E, a não ser que tenham composições iguais, o tampão de uma, não pode ser usado com outras enzimas.

Tempo de digestão.

Eu sei o quanto as incubações “overnight” (de um dia para o outro) são legais e práticas. Mas, por mais que o fabricante diga que a digestão pode levar de 2 a 18 horas, use sempre o tempo mínimo, ou algo mais próximo dele. Digestão longa demais pode resultar na perda de especificidade da enzima.

Contaminação da amostra.

Como já falei antes por aqui e aqui, RNA contaminado é sempre um problema para reações enzimáticas. E com DNA não é diferente. Tenha certeza que sua amostra está pura, sem vestígios de sais, álcool ou outros solventes orgânicos.

Referência:

http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/star_activity.asp#.T1t0szEgeQw

Vivendo (lendo) e aprendendo

Hoje eu li duas coisas, digamos, interessantes, que podem explicar nossos resultados com a ultima biblioteca.

1. Parece que o plasmidio da clontech que, supostamente, é fornecido digerido e fosforilado e pronto para clonagem nao é tao fosforilado assim. Eu nunca me senti confortàvel com isso. Sempre achei que se deve ter um estoque de plasmidio circular (para amplificar mais quando necessario) e EU MESMA digeri-lo e desfosforilà-lo para logo em seguida realizar a reaçao de ligaçao e assim evitar que o plasmidio circularize (sem inserto) antes ou durante a clonagem.

2. Durante o screening inicial da biblioteca, por meio de PCR de colonias, quando nao hà inserto no plasmidio, sao geradas bandas de aproximadamente 500 pb, especificamente com os primers e plasmidio que usei. Advinha qual era o tamanho da banda da maior parte dos clones que eu analisei??? Sim, isso mesmo! Aproximadamente 500 pb!

Mas, tudo bem. Este é o melhor momento para eu descobrir estas coisas. E viva as pessoas que publicam suas experiencias na internet, pois obviamente nenhuma destas informaçoes estava no manual do kit!

Obs: desculpem os erros, teclado italiano.