O pesadelo das RNAses!

Em muitos estudos que lançam mão de técnicas moleculares, o primeiro passo para se ter resultados confiáveis é obter um RNA de boa qualidade, principalmente quando o objetivo é avaliar quantitativamente a expressão gênica através de técnicas como real time-PCR e microarrays. Por enquanto, não vou fazer uma coisa, nem outra. Mas também preciso de RNAs de excelente qualidade para construir bibliotecas gênicas (de cDNA) que contenham o máximo possível de diferentes seqüências gênicas completas.

Antes de discutir o que seria uma amostra de RNA "de qualidade" devo apontar a principal culpada pela sua degradação: as RNAses (ribonucleases). Como o nome sugere, estas enzimas catalisam a hidrólise de moléculas de RNA, ou seja, as cortam em mil pedacinhos, e fazem com que uma amostra de RNA seja bem instável em um ambiente desprotegido. O problema é que as RNAses são praticamente onipresentes e estão presentes principalmente em nós mesmos: a nossa pele, cabelos, unhas, saliva, etc. Por isso, ao manipular não só as amostras de RNA, mas tudo o que for entrar em contato com elas, deve se ter uma série de cuidados (leia-se: paranóia).

Obviamente, o primeiro destes cuidados é sempre usar luvas. Além disso, todos os materiais utilizados devem ser tratados com o objetivo de remover ou inativar estas enzimas (devem ser RNAse free). O que é outro problema, pois elas apresentam uma grande capacidade de renaturação, sendo bastante resistentes tanto à temperatura e pressão elevadas como à desnaturação química. Logo, além de onipresentes, são de difícil inativação. Existem algumas soluções comerciais para isso e os materiais plásticos (ponteiras, tubos, etc) podem ser comprados já livres de RNAses (RNAse-free certified - o que é bem garantido).

O procedimento mais comum, no entanto, é a utilização de um inibidor de RNAses como, por exemplo, o DEPC (Diethylpyrocarbonate). Este composto pode ser usado para tratar soluções (exceto as que contenham Tris) e também vidraria e materiais plásticos. Basta adicioná-lo numa concentração de 0.5-1% ou, no caso de vidrarias e plásticos, deixá-los de molho em uma solução de igual concentração por 18 horas, autoclavando todo o material em seguida (inclusive as soluções), o que converte o composto a etanol e CO2. No entanto, há algumas desvantagens como o preço (bem carinho) e o fato de ser uma substância tóxica (logo, deve-se ter cuidado durante sua manipulação enquanto não for inativado). Além disso, há quem questione sua eficácia. Outra coisa é que as soluções tratadas com DEPC, após autoclavadas, ficam com um cheiro engraçado de fruta meio estragada! O que não é uma desvantagem, só uma curiosidade...

Durante uma disciplina da graduação, um professor disse que esta paranóia toda é desnecessária e que, no laboratório dele, nada é tratado com DEPC. Para evitar a ação das RNAses basta proceder todas as etapas da extração (principalmente a lise celular) em nitrogênio líquido, pois a enzima não funciona numa temperatura tão baixa. Verdade. Mas também não é nem um pouco prático ter que manter as amostras em nitrogênio líquido o tempo todo, sem contar em todas as vezes em que você for manipular as amostras, no futuro.

Resumindo, quem tem que extrair RNA frequentemente acaba desenvolvendo uma paranóia quase patológica, limpando a bancada exaustivamente, não deixando ninguém encostar em nada sem luvas, abrindo as soluções sempre dentro do fluxo, etc. Mas se eu conseguir bons RNAs, vai ter valido a pena!