Clonagem: um caso de amor e odio

Ok. Depois de respirar fundo, resolvi escrever aqui sobre clonagem molecular (de genes), algo com o que estou trabalhando no momento. Apesar de o principal objetivo deste blog ser eu discutir técnicas que utilizo no meu mestrado, eu tenho fugido um pouco do assunto, ou só falo das técnicas que vou usar futuramente, pois a verdade é que me estressa um bocado escrever sobre problemas AINDA não resolvidos! Ainda mais clonagem, com quem tenho uma longa história de amor e ódio e que me persegue (ou eu a persigo) desde que comecei a trabalhar com pesquisa, na minha primeira iniciação científica, há...6 anos!!! (nossa! não tinha me tocado que fazia tanto tempo!)

Mas isso é assunto para mais de um post. Então, vou começar com um post mais básico sobre o assunto, para então chegar onde quero (nas questões que me tiram o sono hehehe) A primeira vista, a clonagem molecular é um processo bem simples. Um simples corta e cola, como resumido no esquema abaixo que mostra a clonagem de um gene (GFP) em um vetor plasmidial. E é realmente só isso: a inserção de um fragmento de DNA (inserto) em um vetor, outro fragmento de DNA, porém com capacidade de se replicar no interior de uma célula hospedeira e assim produzir muitas cópias de si mesmo e por tabela do fragmento nele clonado. O vetor pode ser um plasmídio, um fago ou ainda um BAC (cromossomo bacteriano artifical) ou YAC (Cromossomo artificial de levedura), estes dois últimos para clonagem de fragmentos muito grandes.

>>> Mas por que clonar? <<<


Por milhares de motivos!
- Para isolar e sequenciar um gene particular

- Para expressão da proteína em um sistema biológico (bactérias, leveduras ou mesmo células de mamíferos) clonando-se o gene em um vetor de expressão adequado. Com isso, pode-se obter quantidades suficientes de proteína para estudos estruturais, bioquímicos ou o que mais interessar. Ou realizar estudos funcionais, expressando a proteína nas células de interesse de forma controlada, em um determinado contexto.

- Para fazer construções diversas, como por exemplo, conjugar uma proteína à GFP para estudos de localização celular da mesma ou ainda construir proteínas mutantes.

- Para sequenciamento do genoma de organismos, através da construção de bibliotecas genômicas.

- Para caracterização do transcriptoma de um organismo, através da construção de bibliotecas de cDNA (DNA complementar ao RNA, sintetizado por retrotranscrição).

- E mais 995 motivos que não me lembro agora...

Portanto, uma vez que se tenha um gene clonado, isolado em um vetor, pode-se brincar com ele de diversas formas. Como se conhece as sequências que o flanqueiam no vetor, é possível sequenciá-lo facilmente utilizando os primers adequados. No próximo post, começarei a discutir por que a simples ligação de dois fragmentos de DNA pode não ser tão simples assim....ciao!