29 de março de 2009

Clonagem: um caso de amor e odio

Ok. Depois de respirar fundo, resolvi escrever aqui sobre clonagem molecular (de genes), algo com o que estou trabalhando no momento. Apesar de o principal objetivo deste blog ser eu discutir técnicas que utilizo no meu mestrado, eu tenho fugido um pouco do assunto, ou só falo das técnicas que vou usar futuramente, pois a verdade é que me estressa um bocado escrever sobre problemas AINDA não resolvidos! Ainda mais clonagem, com quem tenho uma longa história de amor e ódio e que me persegue (ou eu a persigo) desde que comecei a trabalhar com pesquisa, na minha primeira iniciação científica, há...6 anos!!! (nossa! não tinha me tocado que fazia tanto tempo!)


Mas isso é assunto para mais de um post. Então, vou começar com um post mais básico sobre o assunto, para então chegar onde quero (nas questões que me tiram o sono hehehe) A primeira vista, a clonagem molecular é um processo bem simples. Um simples corta e cola, como resumido no esquema abaixo que mostra a clonagem de um gene (GFP) em um vetor plasmidial. E é realmente só isso: a inserção de um fragmento de DNA (inserto) em um vetor, outro fragmento de DNA, porém com capacidade de se replicar no interior de uma célula hospedeira e assim produzir muitas cópias de si mesmo e por tabela do fragmento nele clonado. O vetor pode ser um plasmídio, um fago ou ainda um BAC (cromossomo bacteriano artifical) ou YAC (Cromossomo artificial de levedura), estes dois últimos para clonagem de fragmentos muito grandes.



>>> Mas por que clonar? <<<


Por milhares de motivos!
- Para isolar e sequenciar um gene particular
- Para expressão da proteína em um sistema biológico (bactérias, leveduras ou mesmo células de mamíferos) clonando-se o gene em um vetor de expressão adequado. Com isso, pode-se obter quantidades suficientes de proteína para estudos estruturais, bioquímicos ou o que mais interessar. Ou realizar estudos funcionais, expressando a proteína nas células de interesse de forma controlada, em um determinado contexto.

- Para fazer construções diversas, como por exemplo, conjugar uma proteína à GFP para estudos de localização celular da mesma ou ainda construir proteínas mutantes.
- Para sequenciamento do genoma de organismos, através da construção de bibliotecas genômicas.
- Para caracterização do transcriptoma de um organismo, através da construção de bibliotecas de cDNA (DNA complementar ao RNA, sintetizado por retrotranscrição).
- E mais 995 motivos que não me lembro agora...
Portanto, uma vez que se tenha um gene clonado, isolado em um vetor, pode-se brincar com ele de diversas formas. Como se conhece as sequências que o flanqueiam no vetor, é possível sequenciá-lo facilmente utilizando os primers adequados. No próximo post, começarei a discutir por que a simples ligação de dois fragmentos de DNA pode não ser tão simples assim....ciao!

7 comentários:

Vania brasiliensis disse...

hehehe a segunda parte do post está parecendo uma propaganda
clonagem - 1001 utilidades!!! compre clonagem!!! ligue já e também receba inteiramente grátis um kit portátil para PCR!!!

Juliana Americo disse...

hehehe não foi minha intenção fazer propaganda, mas apenas explicar em que contextos alguém pode precisar usar este cazzo, ops, esta técnica...

Eliane, a Lia disse...

olhando assim parece tãaao fácil...

Fabricio disse...
Este comentário foi removido pelo autor.
Fabricio disse...

Antigamente, a clonagem e transformação eram feitas para se obter quantidades grandes do seu inserto. Uma trabalheira só...
Ainda bem que nascemos na era do PCR!!

Juliana Americo disse...
Este comentário foi removido pelo autor.
Juliana Americo disse...

Lia, dependendo do que se que fazer e da qualidade dos reagentes que se tem em mãos, realmente, não é muito complicado....para mim, uma vez, já foi muito difícil fazer uma simples sublconagem de um único gene de sequencia conhecida, mas hoje não é mais. Agora, a dificuldade é clonar milhares genes diferentes e ao mesmo tempo e com grande eficiência. Não é que seja impossível, mas é trabalhoso e pode precisar de muita otimização como vou discutir depois...(quando estiver com mais paciência e tempo, o que não sei se vai ser neste final de semana...hehe)

Fabrício, realmente, ainda bem que temos o PCR! Já pensou ter que clonar toda vez que for necessário simplesmente amplificar uma sequência? Mas a clonagem ainda é útil em muitos outros contextos, como eu disse...
Aliás, a invenção do PCR foi uma revolução e a quantidade de variações desta técnica é enorme...vale um post no futuro!

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