Clonagem: um caso de amor e odio

Ok. Depois de respirar fundo, resolvi escrever aqui sobre clonagem molecular (de genes), algo com o que estou trabalhando no momento. Apesar de o principal objetivo deste blog ser eu discutir técnicas que utilizo no meu mestrado, eu tenho fugido um pouco do assunto, ou só falo das técnicas que vou usar futuramente, pois a verdade é que me estressa um bocado escrever sobre problemas AINDA não resolvidos! Ainda mais clonagem, com quem tenho uma longa história de amor e ódio e que me persegue (ou eu a persigo) desde que comecei a trabalhar com pesquisa, na minha primeira iniciação científica, há...6 anos!!! (nossa! não tinha me tocado que fazia tanto tempo!)

Mas isso é assunto para mais de um post. Então, vou começar com um post mais básico sobre o assunto, para então chegar onde quero (nas questões que me tiram o sono hehehe) A primeira vista, a clonagem molecular é um processo bem simples. Um simples corta e cola, como resumido no esquema abaixo que mostra a clonagem de um gene (GFP) em um vetor plasmidial. E é realmente só isso: a inserção de um fragmento de DNA (inserto) em um vetor, outro fragmento de DNA, porém com capacidade de se replicar no interior de uma célula hospedeira e assim produzir muitas cópias de si mesmo e por tabela do fragmento nele clonado. O vetor pode ser um plasmídio, um fago ou ainda um BAC (cromossomo bacteriano artifical) ou YAC (Cromossomo artificial de levedura), estes dois últimos para clonagem de fragmentos muito grandes.

>>> Mas por que clonar? <<<


Por milhares de motivos!
- Para isolar e sequenciar um gene particular

- Para expressão da proteína em um sistema biológico (bactérias, leveduras ou mesmo células de mamíferos) clonando-se o gene em um vetor de expressão adequado. Com isso, pode-se obter quantidades suficientes de proteína para estudos estruturais, bioquímicos ou o que mais interessar. Ou realizar estudos funcionais, expressando a proteína nas células de interesse de forma controlada, em um determinado contexto.

- Para fazer construções diversas, como por exemplo, conjugar uma proteína à GFP para estudos de localização celular da mesma ou ainda construir proteínas mutantes.

- Para sequenciamento do genoma de organismos, através da construção de bibliotecas genômicas.

- Para caracterização do transcriptoma de um organismo, através da construção de bibliotecas de cDNA (DNA complementar ao RNA, sintetizado por retrotranscrição).

- E mais 995 motivos que não me lembro agora...

Portanto, uma vez que se tenha um gene clonado, isolado em um vetor, pode-se brincar com ele de diversas formas. Como se conhece as sequências que o flanqueiam no vetor, é possível sequenciá-lo facilmente utilizando os primers adequados. No próximo post, começarei a discutir por que a simples ligação de dois fragmentos de DNA pode não ser tão simples assim....ciao!

Blog em crise e o caso "Ruth de Aquino"

Está difícil escolher sobre o que escrever no próximo post, não por falta de idéias, mas por excesso! Nas últimas semanas, baixei váááários artigos interessantes sobre assuntos que gostaria de discutir aqui. A maioria...mentira, todos são sobre genética molecular: controle espacial da expressão gênica, redundância genética, long non coding RNAs, transferência lateral de genes, além de alguns papers sobre o uso de técnicas moleculares na ecologia e na ecotoxicologia e também algumas questões mais metodológicas sobre clonagem e outras coisas que tenho feito...afe, eu realmente gosto de genética! Hoje estou mais certa disso do que quando eu fazia o bacharelado de genética hehehe

Bom, mas eu queria comentar sobre uma reportagem publicada na revista época de autoria da Sra. Ruth de Aquino, redatora chefe da revista em questão: “O besteirol na ciência é melhor que no senado - Ler sobre pesquisas científicas de universidades respeitadas é uma receita certa para dar risada.” Eu não leio esta revista, mas infelizmente muita gente a lê. Fiquei sabendo sobre a reportagem nos blogs discutindo ecologia e brontossauros em meu jardim. A autora tenta ridicularizar a ciência através de argumentos fracos e resumindo-a a meia dúzia de estudos de meia tigela que infelizmente existem por aí. O problema é que muita gente lê esta bendita revista e nem todos os leitores são críticos o suficiente para perceber as falácias na reportagem. Mas isso tudo me faz pensar em como ainda há uma grande carência de divulgação científica digna no Brasil, de meios que discutam e levem a ciência até a sociedade, até as pessoas que não são cientistas e que não estão na universidade, mas que financiam o que é feito dentro dela. A ciência não é apenas para os cientistas e produz conhecimento que é do interesse de todos. Acho que é obrigação de quem está numa universidade pública e fazendo ciência com verbas públicas dar este retorno a sociedade. E tendo como exemplo a reportagem citada, a primeira lição que eu acho que a ciência tem a ensinar as pessoas em geral é a serem críticos. Quando se lê ou assiste qualquer coisa, antes de tomá-las como verdade, temos que ser críticos e questionar os argumentos mostrados (quando existem!). Pensar e questionar antes de se deixar convencer. Não é por que está na revista época, ou na revista X ou na TV que são sempre informações corretas. Em relação à ciência, então, é onde mais se fazem interpretações grosseiramente erradas...

Eu tenho visto muitos blogs de divulgação científica legais. Embora a internet não alcance a todos é uma boa ferramenta, considerando que atualmente somos mais de 20 milhões de brasileiros conectados. Mas este blog não é um blog de divulgação científica, pois não escrevo para um público leigo. Na verdade, sinceramente, eu não penso muito em quem vai lê-lo, pois eu sei que praticamente só 3.45 pessoas o lêem (e de vez em quando) hehehe. Além do que, a idéia inicial era fazer um blog para discutir protocolos, como "sugestão" do meu querido orientador Mauro. Mas é um bom exercício. E gostei desta coisa de blog! hehe mas diante disso tudo pensei em de repente tentar fazer um blog de divulgação científica de verdade, para “não cientistas”. Não seria muito, não alcançaria muita gente, mas já seria alguma coisa...além de um desafio para mim, escrever sobre ciência em uma linguagem compreensível para as pessoas em geral. A primeira parcela do meu débito com a sociedade. Vamos ver se eu dou conta! Enquanto isso, continuarei escrevendo “para as paredes” aqui sobre assuntos que interessam a mim e meia dúzia de pessoas no mundo todo...hehehe

Cell: novo volume dedicado somente a RNA!

Este blog vai virar oficialmente um culto ao RNA! Isso por que acaba de sair um volume especial da revista Cell (minha outra revista preferida!) todinho dedicado ao dito cujo. E ainda por cima com acesso free! Eu ja até tinha consultado uns dois artigos deste volume para os ultimos posts mas nao tinha me dado conta de que se tratava de um volume especial. E tem varias coisas interessantes, inclusive sobre small RNAs e sobre....Long noncoding RNAs! Estes, eu desconhecia a existencia! (por exceçao dos RNA ribossomais e transportadores). Enfim, muito pano para manga...muitas coisas que eu acho interessante e que provavelmente vou acabar escrevendo sobre aqui! Isso se eu puder voltar a usar meu computador... :-***(

Sem medo da biologia molecular

As técnicas de biologia molecular envolvendo manipulação de ácidos nucléicos começaram a surgir principalmente depois que a estrutura do DNA e o pareamento de bases foram elucidados em 1953 por Watson e Crick. Este simples artigo de duas páginas simplesmente abriu as portas para um mundo de novas possibilidades na biologia. Apenas 55 anos depois, a quantidade de abordagens moleculares disponível é enorme e só faz crescer. Genomas inteiros foram e estão sendo seqüenciados. É possível modificar geneticamente organismos, inclusive mamíferos. É possível quantificar a expressão de um, 100 ou 10 mil genes em um único experimento. É possível utilizar microrganismos para produzir em grande escala proteínas de outras espécies, como é feito com a insulina humana em bactérias Escherichia coli. Estes são apenas alguns exemplos destes avanços, mas já representam muita coisa: a quantidade de informação que se pode acessar com estas abordagens é imensa e um dos principais desafios tem sido justamente lidar com tanta informação.

Portanto, a biologia molecular só tem a acrescentar às técnicas já existentes. Com ela, é possível entender os processos biológicos mais intrinsecamente. É possível olhar para o nível mais básico, mas não menos importante de um organismo: o nível genético. As mais diversas áreas das ciências biológicas podem lançar mão da biologia molecular. No entanto, em algumas áreas acredito que ainda há alguma ou muita resistência. Por exemplo, a ecotoxicologia (a minha área) onde alguns são um pouco resistentes a idéia, temendo que a biologia molecular substitua as técnicas tradicionais para testes ecotoxicológicos. Na minha opinião, esta não é uma posição própria de um cientista: se uma técnica é melhor que a outra para responder uma mesma pergunta, que se substitua uma pela outra! Este é o objetivo. Mesmo excelentes cientistas deixaram de fazer grandes descobertas por estarem presos a conceitos e idéias. Não podemos ter medo do novo e nem nos acorrentar a uma idéia! Partimos de pressupostos, mas não podemos deixar que os mesmos ajam como âncoras e nos impeçam de ver uma possibilidade nova a nossa frente. Enfim, ao meu ver, um cientista tem que ter critérios mas tem também que ser open mind.


No entanto, particularmente na ecotoxicologia, por enquanto não acho que seja o caso de substituir uma coisa pela outra. As técnicas moleculares dão acesso a informações em um nível de organização biológica diferente das demais técnicas e vem a acrescentar no nosso entendimento dos mecanismos de toxicidade. E o mais importante é que podem nos permitir prever efeitos em níveis de organização biológica maiores, efeitos tardios e mais graves ecologicamente! A palavra importante aí é “prever”. Podemos prever os efeitos quando ainda há o que ser feito! E nisso a biologia molecular é pioneira. Pois as demais técnicas mostram os efeitos em níveis de organização maiores e, portanto, quando algum dano já foi feito. Pelo menos isso é o que eu penso, mas eu ainda sou peixe (ou seria melhor dizer ostra hehe) pequeno.

RNA: mais que um intermediário da informação genética!

No último post, eu falei um pouco sobre os microRNAs. No entanto, este é apenas um dos tipos de um grande número de small RNAs não codificantes (não são traduzidos em proteínas) que vem sendo descoberto nos últimos anos. Estas pequenas moléculas de RNA têm se mostrado importantes na regulação de uma série de eventos celulares relacionados ao desenvolvimento, defesa contra patógenos e resposta ao estresse através da regulação da expressão gênica praticamente em todas as suas etapas: transcrição, tradução, splicing, controlando a estrutura da cromatina e a estabilidade do RNA mensageiro. Isso aumenta consideralvemente o leque de funções atribuídas ao nosso já antigo conhecido ácido ribonucléico e tem mostrado aos cientistas que o RNA exerce um papel regulatório importante nos processos biológicos.

Para mim, no entanto, a nomeclatura e a classificação dos small RNAs era um pouco confusa e pesquisando achei algumas divergências. Até que encontrei um “background paper” muito bom da Nature que esclareceu quase todas as minhas dúvidas: claro, objetivo e breve! Não é a toa que a revista tem o índice de impacto que tem.

(abre parênteses) Estou cada vez mais convencida de que quanto maior um texto, pior. Para explicar claramente um conceito ou uma idéia, não é preciso se estender muito. Quando escrevemos muito, em geral, é por que não sabemos ou não entendemos bem sobre o que estamos falando. (fecha parênteses)

Pois bem, segundo o paper da Nature, os principais tipos de small RNAs são os seguintes:

1) micro RNAs (miRNAs) – com 20-22 nucleotídeos, regulam negativamente a expressão gênica, ligando-se aos mRNAs e impedindo a sua tradução. Acredita-se que esta ligação se dê por meio de um pareamento de bases imperfeito, gerando uma “bolha” no duplex miRNA:mRNA o que bloquearia a tradução pelo ribossomo.

2) Small interfering RNAs (siRNAs) – com aproximadamente 22 ntds, são os mediadores da “interferência de RNA” que tem sido amplamente utilizado para o silenciamento gênico experimental através da introdução de siRNAs sintéticos. Os siRNAs e miRNAs são produzidos a partir da mesma via a partir de precursores de RNA dupla fita, no entanto, se diferenciam pelo modo de ação. Enquanto, o miRNA impede a tradução do mRNA, o siRNA marca o mRNA alvo para degradação por endonucleases, pois ao se ligar aquele, o faz por meio de um pareamento de bases perfeito. Acredita-se que tenha surgido como um mecanismo de defesa contra moléculas de ácido nucléico invasoras em plantas (vírus, transposons...)

3) small nucleolar RNAs (snoRNAs) – clivam o préRNA ribossomal em suas subunidades funcionais 18S, 5.8S e 28S.

4) small nuclear RNAs (snRNAs) – são constituintes do spliceossoma (maquinaria envolvida no splicing processo através do qual são removidos os íntrons dos RNA mensangeiros). Alguns snRNAs apresentam atividade enzimática durante o splicing.

Bom, isso tudo para mim só faz crescer o argumento de que a complexidade dos organismos está intimamente relacionada com a capacidade de regular como os seus genes funcionam, como eu já discuti aqui antes. Além de que pode explicar por que os genomas são constituídos principalmente por sequências não codificantes: provavelmente, a maior parte do genoma está envolvida com sua própria regulação!


Para saber mais:

Buckingham S. The major world of microRNAs. Nature, 2003.

Carthew and Sontheimer. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell, 2009.

Kawaji H, Hayashizaki Y (2008) Exploration of Small RNAs. PLoS Genet 4(1)

National Science Foundation. "RNA Research Reveals New Responsibilities." ScienceDaily 6 September 2005. 13 March 2009

microRNAs, macroPossibilidades

Já algum tempo que tenho ouvido falar dos microRNAs, uma nova classe de RNAs curtos e não codificantes (não são traduzidos em proteínas), porém, não menos importantes! Estes pequenos segmentos de RNA (~20 bases) hibridam nos seus RNAs mensageiros alvo e assim regulam negativamente a sua tradução ou induzem a sua degradação. Em animais, os microRNAs hibridam com o mRNA alvo na sua UTR 3’ (untranslated region) por meio de um pareamento de bases imperfeito o que acaba por impedir o prosseguimento da tradução. Já em plantas, há complementariedade completa (ou quase) entre o microRNA e o seu alvo e portanto o pareamento entre os dois é perfeito, resultando na degradação por clivagem do mRNA alvo devido a formação de uma dupla fita de RNA que é imediatamente degradada.

O importante nesta história é que os microRNAs constituem mais um mecanismo de regulação da expressão gênica. Mais uma forma de se controlar com especificidade quando, onde e com que intensidade os genes são expressos. A importância evolutiva destes mecanismos refinados de controle da expressão gênica eu já discuti um pouco por aqui antes. A meu ver, no entanto, mais importante que saber quando um determinado gene é expresso, ou não, é identificar e entender que mecanismos o regulam. Entendendo-se esta mecânica e toda a sucessão de eventos moleculares envolvidas poderíamos, dadas as circunstâncias, prever como os genes se comportariam e com isso ter uma idéia das conseqüências, dos efeitos biológicos das mais diversas “circunstâncias”: doenças, estresse térmico, oxidativo, exposição a poluentes, drogas e fármacos, etc.

Colocado assim, talvez pareça simples, mas não é. Os genes são muitos e, para a maioria das espécies, os seqüenciados são poucos. E se não conhecemos os genes, como estudá-los? As circunstâncias são infinitas. Os mecanismos de regulação gênica também parecem ser muitos e complexos. Mas o que me chamou atenção nos microRNAs é que um mesmo microRNA pode regular a expressão de vários genes alvo, assim como fatores de transcrição regulam um grupo de genes, e assim influenciar diferentes vias simultaneamente. Cada via de regulação gênica tem como alvo um grupo de genes correlacionados que se comportam da mesma forma, dada uma certa circunstância. Os genes, por sua vez, podem estar sujeitos a regulação por diferentes vias e, portanto, podem fazer parte de diferentes grupos, dependendo das circunstâncias.

O que eu concluo disso tudo, que pode já ser óbvio para muitos, é que é importante e mais fácil primeiramente estudar os elementos chaves desta rede de vias de regulação gênica. E, acredito, que os microRNAs sejam um elemento chave importante e que até então era ignorado. Por exemplo, resolvi escrever este post quando estava lendo um paper que descrevia a identificação de novos microRNAs induzidos por metais pesados em arroz e também os possíveis alvos destes microRNAs (Huang et al, 2008). Então, acho que é mais parcimonioso avaliar o nível de expressão de um destes microRNAs (e por tabela dos seus genes alvo) do que olhar para cada um dos genes sujeitos a sua regulação...É claro, atualmente, existe a técnica de microarrays, que possibilita avaliar a expressão de milhares de genes e inclusive já vi trabalhos de microarray para microRNAs. No entanto, esta técnica ainda é muito cara e não está disponível para a maioria dos laboratórios. Então, para quem só possa fazer um PCR quantitativo ou semi quantitativo ou northen blot, avaliar a expressão de um só microRNA pode significar acessar a informações sobre os níveis de expressão gênica de muitos outros genes.

Além disso, a regulação por microRNAs parece ser bem comum (no genoma humano, já foram identificados 462 microRNAs e estima-se que este número chegue a 1000) e até pouco tempo não era nem considerada! É mais uma forma de regular a expressão dos genes e a nível pós transcricional, o que significa, por exemplo, que, ao menos em animais onde a tradução é apenas bloqueada pelos microRNAs, esta regulação não seria detectada por técnicas que avaliam os níveis de mRNA.

...talvez tenha sido um pouco confusa neste post! Isso que dá meses sem postar.

Tic-tac...tic-tac

Lendo um livro de Rubem Alves chamado “Filosofia da Ciência – Introdução ao jogo e suas regras” me deparei novamente com uma analogia que considero perfeita para entender o que é, como funciona, o que busca e o que produz a ciência.

Imagine-se vendo um relógio pela primeira vez e sendo impossível abri-lo como faria para compreender o seu mecanismo de funcionamento?

A ciência busca justamente resolver problemas como este, compreender mecanismos de funcionamento sem poder olhar diretamente para eles, sem ter acesso direto à realidade. A ciência busca o invisível.

E o primeiro passo é olhar para os fatos. Neste caso, por exemplo, um mostrador, com ponteiros que giram regularmente, a velocidades diferentes, mas constantes. Mas os fatos são apenas dados, não fornecem explicação alguma sobre o mecanismo do relógio e, na verdade, constituem o problema a ser resolvido pelo cientista.

Neste ponto, a imaginação é essencial, como disse Eisntein, “a imaginação é mais importante que o conhecimento”. É necessário que o cientista dê um “pulo mental” e construa mentalmente o que ele não pode ver: um mecanismo que explique os fatos, que são os dados a que se tem acesso direto. A estes mecanismos assim construídos chamamos de modelos. As pessoas tendem a achar que modelos e teorias científicas são verdadeiras, mas modelos não são cópias da realidade, pois não temos acesso a ela, não podemos abrir o relógio para saber se o modelo corresponde ao real mecanismo e, portanto, não podemos dizer que são verdadeiros. Mas, então que validade tem os modelos e teorias científicas? Aceitamos os modelos e as teorias que funcionam. Que se mostram universalmente válidos, cujas previsões se mostram corretas. E para isso, pagamos para ver, pesquisamos, testamos, experimentamos.

Uma questão interessante que Rubem Alves discute é que, quando observamos os fatos nos quais baseamos nossos modelos, não temos garantia alguma de que no futuro, a natureza irá se comportar da mesma forma que no passado,  “Em todos os raciocínios derivados da experiência existe um passo dado pela mente que não é apoiado por nenhum argumento ou processo do entendimento” (David Hume) e este passo é “a passagem do passado para o futuro, do particular para o geral que se dá por meio da estreita e ignorada ponte da fé e da aposta”...mas, como eu disse antes, em ciência, não fazemos apenas apostas e damos palpites (modelos), mas pagamos para ver...experimentando, testando a funcionalidade, universalidade e a capacidade de previsão dos modelos e teorias em que apostamos nossas moedas. A ciência produz modelos hipotéticos e provisórios da realidade que serão aceitos enquanto funcionarem de forma adequada e que serão colocados em questão e eventualmente substituídos assim que deixarem de cumprir suas promessas...

Obs.: a primeira vez que vi esta analogia do relógio foi durante o meu estágio no CAp da UFRJ. Na verdade, não era um relógio, mas uma caixa construída pelos professores que tinha algumas alavancas (na verdade, eu não sei como funciona, pois não usei com os alunos das minhas turmas). Mas a idéia era que os alunos desenvolvessem um modelo para explicar como funcionava a caixa, sem, obviamente, olhar seu interior e com isso discutir os conceitos de ciência e de modelos científicos. Queria eu ter tido uma aula assim, ainda no início do ensino fundamental! A maioria das escolas não se dá ao trabalho de discutir estas questões nas aulas de ciências...mas apenas coloca o conhecimento científico como algo definitivo e estático.

Vivendo (lendo) e aprendendo

Hoje eu li duas coisas, digamos, interessantes, que podem explicar nossos resultados com a ultima biblioteca.

1. Parece que o plasmidio da clontech que, supostamente, é fornecido digerido e fosforilado e pronto para clonagem nao é tao fosforilado assim. Eu nunca me senti confortàvel com isso. Sempre achei que se deve ter um estoque de plasmidio circular (para amplificar mais quando necessario) e EU MESMA digeri-lo e desfosforilà-lo para logo em seguida realizar a reaçao de ligaçao e assim evitar que o plasmidio circularize (sem inserto) antes ou durante a clonagem.

2. Durante o screening inicial da biblioteca, por meio de PCR de colonias, quando nao hà inserto no plasmidio, sao geradas bandas de aproximadamente 500 pb, especificamente com os primers e plasmidio que usei. Advinha qual era o tamanho da banda da maior parte dos clones que eu analisei??? Sim, isso mesmo! Aproximadamente 500 pb!

Mas, tudo bem. Este é o melhor momento para eu descobrir estas coisas. E viva as pessoas que publicam suas experiencias na internet, pois obviamente nenhuma destas informaçoes estava no manual do kit!

Obs: desculpem os erros, teclado italiano.

RNA quality, again...

Durante este período fora, não vou abandonar o blog, mas usá-lo principalmente para ir contando como andam os experimentos aqui na Itália e o que mais eu for aprendendo de interessante...

Bom, ainda não comecei os experimentos, pois devo esperar as amostras e além disso determinar realmente o que vamos fazer e de quais reagentes iremos precisar. Assim que estiver com minhas amostras de RNA (total e poli-A) em mãos a primeira coisa que devo fazer é precipitá-las e checar a qualidade delas novamente. Isso inclui tudo aquilo que já discuti aqui e mais uma coisa que o Francesco me disse ser fundamental que é checar o tamanho da banda de rRNA 18S, pois se estiver muito abaixo do esperado é sinal de degradação (mesmo sem rastro) e todos os géis que eu fiz até então foram sem padrão :/. O ideal é usar um padrão de RNA, mas na falta de um, pode-se usar um de DNA também, para se ter ao menos uma idéia, pois o padrão de migração é um pouco diferente.

Parece que não é apenas eu quem tem problemas para extrair RNA de músculo de moluscos. É comum a razão 260/230 ficar baixa devido a contaminantes (principalmente, polissacarídeos). Aqui eles costumam extrair RNA do tecido congelado, ao invés de em RNA later, o que reduz o problema e é mais eficaz para inativar RNAses e, além disso, costumam fazer uma precipitação com cloreto de Lítio. Já tinha pensado em fazer as duas coisas no Brasil, mas não saiu do papel, pois foi pouco antes de vir para cá. Parece que a precipitação com cloreto de lítio é mágica, remove todos os contaminantes e não se perde nada da amostra. E o protocolo é bem simples. Vamos ver. Eu devo fazer com algumas das minhas amostras de músculo, pelo menos. A verdade dura e crua é que um RNA perfeito é essencial, principalmente, quando se quer construir uma biblioteca de cDNA, um processo longo e caro cujo resultado final pode ser totalmente comprometido pela qualidade do RNA utilizado. Então, o melhor é ser conservador ao extremo em relação as amostras de RNA.

Outra coisa interessante que o Francesco falou é que após a reação de clonagem e antes da transformação, devemos checar a resistência das bactérias ao antibiótico utilizado, pois se a linhagem exibir alguma resistência intrínsica, a seleção dos clones transformantes não vai ser eficiente. Pode ter sido o que aconteceu com a biblioteca que construímos ano passado, pois o número de colônias foi bem grande.

That's all for now.

Ciao ciao!

SPACE INVADERS

Apesar do título sugestivo, não, eu não vou falar sobre vida extra-terrestre! Eu ia continuar com a questão do desenho experimental, mas este mês foi publicado um artigo super interessante que me remeteu aos (velhos?) tempos da graduação em genética e não resisti comentar aqui.

A história começa quando um grupo da Universidade do Texas em Arlington (EUA) estava estudando transposons no genoma da espécie Otolemur garnettii (ou bushbaby). Transposons são seguimentos de DNA que podem se mover dentro de um mesmo genoma fazendo uma cópia de si mesmo e a inserindo em outro local ("copy and paste”) ou “recortando-se” de um local para se inserir em outro ponto do genoma (“cut and paste”) e neste processo podem carregar genes adjacentes e causar mutações.

Eles então resolveram comparar as seqüências de uma superfamília de transposons que acharam no bushbaby com as seqüências de outros animais. E, surpreendentemente, eles encontraram seqüências praticamente idênticas em 7 outras espécies inclusive em uma espécie de anfíbio e em um réptil, enquanto que as mesmas seqüências não foram encontradas em outras 19 espécies de mamíferos pesquisadas. O intrigante é que estas seqüências altamente conservadas apresentam um padrão descontinuo na árvore filogenética, aparecendo em grupos não diretamente relacionados, como se tivessem dado saltos entre eles. Estimou-se que as seqüências tenham surgido e evoluído por pelo menos 15 milhões de anos, enquanto estes grupos divergiram há 350 milhões de anos. Como os transposons pareciam “surgir do nada” nas diferentes espécies analisadas, eles deram o nome de “Space invaders” (SPIN). Mas, então, como explicar a ocorrência dos spacer invaders nestes grupos?

Estes dados são uma forte evidência de que estas seqüências não foram adquiridas verticalmente, ou seja, através da reprodução de ancestrais, mas horizontalmente. A transferência horizontal (ou lateral) de genes consiste na transferência de material genético de um organismo para outro “não descendente” e pode ocorrer mesmo entre organismos de espécies diferentes. Este evento é muito comum entre bactérias que podem, por exemplo, assimilar fragmentos de DNA liberados após a lise de outras bactérias presentes no ambiente.

Mas em eucariotos isso não é nada comum. Como estas seqüências “saltaram” entre os genomas de mamíferos e répteis? Feschotte, líder do grupo que realizou o estudo, acredita que possivelmente estes transposons tenham sido transferidos entre estas diferentes espécies por meio de infecções virais. A introdução dos SPINS nestes genomas têm uma importância evolutiva grande uma vez que, por exemplo, no genoma do tenrec estas seqüências se duplicaram até atingir um número de 100 mil cópias e no rato e no camundongo, estes transposons deram origem a um novo gene funcional.

O trabalho “Repeated horizontal transfer of a DNA transposon in mammals and other tetrapods” foi publicado na PNAS de outubro/2008.

Você pode ler sobre os SPINs na G1 ou na GenomeWeb News (em inglês, com cadastro).

Desenho experimental é tudo!

Todos que trabalham com ciência sabem ou deveriam saber disso. Isso porque o desenho experimental é crucial para que se consiga o tipo e a quantidade de dados que realmente podem responder a pergunta de interesse. Logo, o primeiro passo é sempre identificar que perguntas específicas serão investigadas com o experimento em questão e definir quais tratamentos (grupos experimentais) e controles utilizar, assim como quais variáveis (os “tipos de dados”) devem ser monitoradas em função dos tratamentos utilizados para que seja possível responder as perguntas estabelecidas. Uma outra questão extremamente importante é identificar as fontes de variabilidade existentes. Todas estas questões são assunto para 1 ano de posts...mas, recentemente, eu tive uma aula sobre desenho experimental na área de proteômica onde se discutiu a problemática das fontes de variabilidade e a importância das réplicas, principalmente, biológicas...questões sobre as quais eu já vinha pensando e que despertaram ainda mais meu interesse. Portanto, por enquanto, vou me focar neste ponto.

Por que identificar as fontes de variabilidade é tão relevante? Em geral, o objetivo de um experimento é avaliar os efeitos de um “tratamento”, por exemplo, a exposição a uma substância tóxica, no organismo ou modelo de estudo. Em contraste com um estudo de “observação” onde dados são obtidos e analisados sem que as condições sejam alteradas. Para determinar que os efeitos observados através de um experimento são resultado do tratamento utilizado é preciso ter o máximo de controle sobre todas as possíveis fontes de variabilidade (que não o tratamento) que podem interferir nos resultados para que desta forma se possa determinar que os efeitos observados estão de fato relacionados com o tratamento. Estas fontes podem ser tanto técnicas quanto biológicas. Em geral, as pessoas se preocupam mais com a variabilidade técnica cujo grau depende, obviamente, das técnicas utilizadas. No entanto, a variabilidade biológica também pode ser uma grande pedra no caminho, especialmente, em experimentos que avaliam alterações na expressão gênica de milhares de genes como os microarranjos de DNA e a proteômica. As fontes de variabilidade biológica são inúmeras: diferenças genéticas, de idade, sexo e de estado nutricional entre os indivíduos, no caso de cultura de células: o número de passagens, a linhagem utilizada, a densidade de células e o tempo de cultivo da linhagem (no caso de culturas primárias) são relevantes.

Para lidar com esta variabilidade a utilização de réplicas (técnicas e biológicas) é essencial. Uma réplica técnica consiste em analisar uma mesma amostra biológica independentemente mais de uma vez, enquanto que uma réplica biológica consiste em analisar amostras biológicas provenientes de diferentes indivíduos. Esta estratégia auxilia a reduzir a variabilidade não relacionada com o tratamento e, assim, a detectar variações “verdadeiras” com maior precisão, além de possibilitar que os dados sejam avaliados estatisticamente. No curso de proteômica, foi comentado que, estatisticamente, as réplicas biológicas são mais relevantes que as técnicas e que vale a pena aumentar o número de réplicas biológicas mesmo em detrimento do número de réplicas técnicas. Mas, falando de estatística eu estou entrando em terreno praticamente desconhecido para mim...ao menos por enquanto, pois pretendo e, principalmente preciso(!!!) mudar isso.
Bom, eu escrevi uma página e acho que não disse muita coisa, então, continuo na próxima vez! Ciao!

O fim (?) da novela "primer design"

Só para fechar esta questão dos primers: um guideline no site da Premier Biosoft (a empresa do netprimer e do primerpremier) me ajudou bastante fornecendo os valores toleráveis de deltaG para cada uma das possíveis estruturas secundárias para os primers em questão. O deltaG (variação de energia livre) indica a quantidade de energia necessária para romper com a estutura secundária e é utilizado como uma medida da estabilidade destas estruturas. Quanto mais negativo for o deltaG, mais estável é a estrutura e, portanto, piores são os efeitos no PCR! Mas, não é preciso ficar desesperado como eu fiquei quando o programa acusar estruturas em todos os seus primers. Se o deltaG for baixo, provavelmente, aquela estrutura não vai se manter na temperatura de anelamento dos primers durante o PCR e não vai interferir na eficiência da reação de amplificação. Por enquanto, meus primers estão ok, embora nem todos estejam funcionando (mas acredito que por outros motivos).

Para saber mais e conhecer os valores de deltaG toleráveis em cada caso: http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html

No próximo post, vou falar sobre outro tipo de "design" :)

Primer design

Desenhar um par de primers é bem simples, certo? É só desenhar oligonucleotídeos homólogos às regiões que flanqueiam a sua seqüência alvo. Na verdade, não é tão simples assim, ao menos se você realmente quer que seu PCR funcione. E que funcione bem: com uma eficiência alta e sem bandas não específicas. Além disso, depende muito de o que você quer amplificar (DNA genômico, um gene clonado em um vetor, cDNA?). A primeira vez em que eu desenhei um par de primers na minha vida, foi bem simples, eu fiz literalmente à mão. Peguei a seqüência ao alvo (um gene já seqüenciado e isolado em um vetor plasmidial) e desenhei um oligo para anelar no início e outro para anelar no fim do gene e adicionei um sítio de restrição a cauda 5’ de cada um dos primers, para posterior clonagem do amplicom em um vetor diferente. Depois chequei num programa de computador (oligocalculator) o conteúdo de GC e o Tm, para saber se eram compatíveis. E os primers funcionaram muito bem, obrigado! Mas hoje, eu acho que dei um pouco de sorte, pois eu não chequei várias coisas nestes primers que poderiam ter condenado o PCR a um desastre!

Agora, estou eu novamente desenhando primers, mas desta vez, usando um programa para isso, o primer3. Mas o contexto é bem diferente: tenho apenas o começo da seqüência alvo, logo, para os primers reverse e internos (nested), preciso lançar mão de um alinhamento de seqüências conhecidas para o mesmo gene de interesse em outras espécies, sendo que queremos amplificar o cDNA, mas nos bancos de dados há apenas seqüências genômicas disponíveis (sem os íntrons anotados, é claro, para facilitar).

Bom, mas quando eu já tinha feito quase todos os primers que eu queria com o primer3, comecei a ficar preocupada se este programa realmente fornecia oligos que não formem estruturas secundárias (grampos) e que não formassem dímeros. Procurei na Internet um programa que verificasse isso, especificamente, só para garantir, e achei o Netprimer, que verifica o potencial do primer em forma grampos (hairpin), dímeros, dímeros cruzados, seqüências palindrômicas, repetições e “runs” de um nucleotídeo (pelo menos 3 nucleotídeos iguais repetidos). Todas estas coisas podem diminuir em muito a eficiência do PCR: um primer que forma um grampo, não vai hibridizar na seqüência alvo (ou com uma eficiência muito baixa), se os primers formam dímeros, competem com a seqüência alvo, ou seja, a quantidade de primer realmente disponível para hibridizar na seqüência alvo, diminui drasticamente, etc. E qual foi a minha surpresa quando submeti as seqüências dos meus primers neste programa? De 4 primers, apenas 1 sobreviveu! Sendo que para cada um destes primers, o primer3 ainda me deu outros 4 oligos alternativos, mas todos eles também tinham algum problema! Ou seja, 15 primers diferentes e TODOS eles tinham algum (ás vezes, mais de um) destes problemas, como nas figuras abaixo, onde a primeira mostra a formação de um grampo e a segunda, de um dímero.

Além destas estruturas, ao se desenhar os primers, deve-se ter outras preocupações:
- Evitar “runs” de 3 ou mais G ou C na terminação 3’, pois pode diminuir a especificidade, uma vez que isso aumenta a estabilidade de hibridizações não específicas e a região 3’ é crítica para a especificidade e sensibilidade do PCR.
- Evitar um nucleotídeo T na terminação 3’.
- Evitar complementaridade entre os primers (para evitar a formação de dímeros).

Há muito mais sobre primers, mas como eu ainda não resolvi os problemas dos meus próprios, não vai dar para me estender além disso por aqui agora...

O jogo da evolução

Este mês, foi publicada uma reportagem bem legal na revista "Scientific American Brasil" com o título "O jogo da evolução" onde são discutidos dois assuntos que eu acho interessantes: evolução e controle da expressão gênica. Resolvi escrever uma pequena "resenha" e discutir alguns pontos do artigo aqui:


Como surgiu a imensa diversidade de espécies existentes é uma pergunta que há muito tempo os cientistas tentam responder. Com a identificação do DNA como o material genético e dos genes como as unidades que codificam as proteínas (embora esta definição não seja a mais adequada atualmente), a expectativa era que fossem encontradas diferenças genéticas correspondentes a diversidade anatômica observada entre as espécies. No entanto, o que se tem observado é que as espécies são geneticamente mais semelhantes em relação à vários aspectos (número, tipos e seqüência dos genes) do que se imaginava. Os cientistas resolveram, então, estudar os genes relacionados ao desenvolvimento, uma vez que as diferenças anatômicas entre as espécies devem resultar de diferenças nestes processos. Mais uma vez se surpreenderam ao observarem que tais genes são mais conservados ainda! Chegou-se a um aparente paradoxo: como as espécies podem ser tão distintas anatomicamente e ao mesmo tempo tão semelhantes geneticamente?


A resposta parece estar nos mecanismos de controle da expressão gênica. Embora os organismos possuam conjuntos de genes semelhantes, o que os tornaria diferentes é o contexto em que tais genes são expressos: quando, onde e em que intensidade são expressos. Em eucariotos, os mecanismos de controle da expressão gênica vão muito além de diferentes tipos promotores e fatores de transcrição. Cada gene contém pelo menos uma seqüência atenuadora (ou enhancer) que consiste em uma seqüência regulatória que pode estar praticamente em qualquer lugar abaixo, acima ou dentro (em um íntron) do gene. Os vários enhancers de uma mesmo gene irão controlar sua atividade em diferentes tecidos e momentos do ciclo de vida do animal. Consequentemente, a transcrição de um gene pode ser finamente regulada o que possibilita a sua expressão em diferentes contextos, ampliando a sua funcionalidade.


De fato, sabe-se que ao mesmo tempo que os genomas eucarióticos são bem maiores que os de procariotos, a maior parte deles é constituída por seqüências não codificantes. Então, como explicar o maior complexidade dos organismos eucarióticos? Os grandes genomas estão justamente relacionados com o surgimento de mecanismos de controle da expressão gênica mais complexos, os quais são responsáveis pela maior complexidade destes organismo. E pensar que boa parte do genoma eucariótico ainda é chamada por muitos de "DNA lixo"...Nada existe sem um motivo, principalmente, se tratando de DNA: para que gastar energia mantendo e replicando milhões de pares de bases "inúteis"? O argumento que seria para diminuir a probabilidade de ocorrência de mutações em seqüências gênicas nunca me convenceu!


Tais genes, expressos em diferentes contextos onde exercem funções distintas, são chamados de pleiotrópicos. Uma mutação em um gene deste tipo dificilmente seria tolerada, pois afetaria muitos processos. A principal implicação evolutiva do controle da expressão gênica por seqüências atenuadoras é que mutações nestas seqüências podem alterar pontualmente uma característica sem que o gene responsável seja alterado, ou seja, pode-se alterar a expressão de um gene específico somente em um tecido ou em um momento do desenvolvimento sem que as demais funções do mesmo sejam alteradas. Isto é bem discutido no artigo em questão através de vários exemplos interessantes. Para entendermos as diferenças entre as as formas de vida, devemos olhar para além dos genes e proteínas: para como estes genes e proteínas são rigidamente regulados, um campo ainda pouco conhecido. Além das seqüências atenuadoras, há inúmeros mecanismos de regulação da expressão gênica, entre eles a regulação por microRNAs. Eu particularmente pouco sei sobre isso, mas acho bem interessante...

Como acabei me desviando em alguns pontos, e sendo bem sucinta em outros, caso alguém queira ler a reportagem na íntegra (que descreve alguns casos bem legais mais detalhadamente), ela também está disponível online, neste link:

http://www2.uol.com.br/sciam/reportagens/o_jogo_da_evolucao.html

Normalização de cDNA

Volto às bibliotecas de cDNA, mas agora para falar sobre o método de normalização que comentei no penúltimo post. Como eu havia dito, as grandes diferenças nos níveis de expressão dos genes e, logo, nos níveis de RNAm, dificultam o isolamento de genes pouco expressos através da análise dos clones de uma biblioteca de cDNA. Em uma biblioteca de cDNA normalizada, os diferentes cDNAs estão presentes, mais ou menos, na mesma proporção. Mas como normalizar uma biblioteca?

Os principais métodos de normalização de bibliotecas se baseiam em um princípio da cinética de reassociação do DNA. Durante o processo de reassociação do cDNA, após desnaturação (separação da dupla fita), as seqüências presentes em maior número irão se reassociar mais rapidamente do que as presentes em um menor número de cópias. Como conseqüência, primeiramente formam-se duas frações: uma fração de cDNA reassociado (ds cDNA, dupla fita) constituída pelas seqüências mais freqüentes e outra de cDNA fita simples (ss cDNA) constituída pelas seqüências mais raras (mas que também contém algumas cópias das seqüências mais freqüentes).

[Dedução minha] Isto acontece por uma questão de probabilidade. Tem-se uma mistura de cDNA complexa com milhares de cDNAs diferentes. Elevando-se a temperatura, o cDNA é desnaturado: as pontes de hidrogênio que mantém as duas fitas unidas são rompidas. Reduzindo novamente a temperatura, o cDNA se reassocia: as moléculas fitas simples se hibridizam com as respectivas fitas simples complementares a elas, voltando a forma dupla fita. A probabilidade de isto acontecer (as duas fitas simples complementares se reassociarem) é proporcional à concentração das mesmas na mistura: quanto maior a concentração, maior a probabilidade de uma fita encontrar a outra complementar na mistura.

Portanto, durante a renaturação do cDNA, as seqüências mais abundantes formam uma fração dupla fita e as menos freqüentes, uma fração fita simples. Esta última é a fração normalizada, onde os diferentes genes estão presentes mais ou menos em igual número. Os métodos de normalização existentes se diferenciam na forma de separação de uma fração da outra. Para não me estender ainda mais, não vou explicar os outros métodos, mas em geral todos possuem muitas etapas, exigem muito tempo e trabalho e não são adequados para a normalização de seqüências de cDNA completas. Como eu sou preguiçosa, procurei um mais fácil! hehehe Na verdade, foi um dos primeiros métodos de normalização sobre o qual li, então, eu dei sorte mesmo :)

O método de normalização em questão se chama “DSN (duplex-specific nuclease) normalization” e foi desenvolvido por um grupo de Moscou, Rússia (Zhulidov et al, 2005). Para isolar a fração normalizada fita simples, eles utilizam uma enzima chamada DSN (purificadas por eles a partir do garanguejo Paralithodes camtschatica). Esta enzima, como o nome já diz, é uma nuclease que cliva especificamente DNA dupla fita (tanto o duplex DNA-DNA quanto DNA-RNA, o que possibilita proceder a normalização já no produto da reação de síntese da primeira fita de cDNA). Como a DSN é termoestável e funciona a 70ºC, é possível utilizá-la para degradar a fração fita dupla na temperatura em que ocorre a renaturação do DNA. A temperatura de 70ºC também tem a vantagem de evitar que hibridizações não específicas ocorram e que transcritos sejam perdidos devido à formação de estruturas secundárias (que também seriam clivadas pela enzima). A fração fita simples remanescente é então amplificada por PCR. Na gelzinho a baixo, é possível observar o resultado da normalização. Na primeira raia do gel, foi aplicado um padrão, na segunda, o cDNA antes da normalização (com bandas nitidamente mais fortes, referentes a genes altamente expressos) e na terceira, o cDNA após o tratamento com a enzima DSN, onde não se observam mais as bandas existentes anteriormente. Muito bonitinho.

Mas, como nem tudo é perfeito, na etapa de amplificação do ss cDNA, há um segundo problema. Em uma mistura complexa de cDNA, com fragmentos de tamanhos muito distintos, os menores fragmentos serão amplificados mais eficientemente que os maiores pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Isto significa que a amplificação do cDNA, anterior a sua clonagem em um vetor, resulta na perda das seqüências raras e mais longas, assim como na redução do comprimento médio dos insertos da biblioteca.

Para resolver isso, eles lançaram mão de um método chamado Regulation of Average Length of PCR Product (Regulação do comprimento médio do produto da PCR) desenvolvido por eles anteriormente (Shagin et al 1999). Seguindo-se esta abordagem, o cDNA fita simples é amplificado por PCR utilizando apenas um primer (“single primer PCR”), o mesmo primer funciona como foward e reverse. Como resultado, após um 1 ciclo, a molécula de DNA gerada desta forma contém terminações invertidas e, portanto, complementares (ITRs - inverted terminal repeats) referentes ao primer. No próximo ciclo do PCR, quando as moléculas de cDNA molde forem desnaturadas, as terminações invertidas de uma molécula fita simples tendem a hibridizar uma com a outra, competindo com os primers e inibindo, portanto, a amplificação. Este anelamento entre as terminações da molécula e, portanto, a inibição da amplificação pela polimerase serão maiores nos fragmentos menores, pois nestes, a probabilidade de uma extremidade encontrar a outra é bem maior que em fragmentos maiores, como observado na figura abaixo. Logo, este protocolo permite inibir a amplificação de fragmentos pequenos, favorecendo a amplificação das seqüências completas.

Concluindo, na abordagem proposta por Zhulidov e seus colegas, são combinadas três abordagens para construir uma biblioteca de cDNA normalizada (baixa redundância) e enriquecida com seqüências completas: 1) A tecnologia SMART que otimiza a síntese e amplificação de seqüências completas na reação de síntese da 1ª fita e na sua amplificação (que já usamos no lab e que não expliquei aqui) 2) A normalização do cDNA pela DSN e 3) A regulação do comprimento médio do produto da PCR durante a amplificação da fração normalizada. Pelo que vi até agora, acho que é a melhor forma de se construir uma biblioteca de cDNA normalizada.

No entanto, no curso de ecotoxicogenômica do ECOTOX, os gringos passaram voando por um slide que falava sobre este método e resolvi perguntar depois se era “isso tudo mesmo”. Eles disseram que funciona bem e que não é difícil de fazer, mas que quando se faz um pool das colônias transformantes para amplificação da biblioteca e posterior estoque, a normalização é perdida, pois os clones (de bactéria) crescem em velocidades diferentes e, no final das contas, estarão presentes em proporções diferentes. Se for assim mesmo, isto significa que, após a transformação, seria necessário analisar o maior número de colônias possíveis ou estocar as colônias isoladamente (crescê-las em placas de 96 ou 384 poços, adicionar glicerol e congelá-las).