SHORT TIPS - Quando as bandas do gel sorriem...

...não é um bom sinal! 


Depois de correr uma reação de PCR em um gel agarose, você já se deparou com uma banda tão torta que chega a parecer um sorriso? 

Apesar do DNA ser o código da vida, não, ele não está criando vida própria. Alguns pequenos erros explicam isso:

1. O gel não ficou complemente submerso no tampão de corrida.
2. O volume de amostra aplicado no gel foi muito pequeno (deve ocupar pelo menos 1/3 do volume do poço).
3. Condições de corrida impróprias. A pressa pode nos tentar a aumentar a voltagem. Mas existe um limite de voltagem que depende do tamanho do gel e da cuba. Não use mais que 5-8 V* por cm (de distância entre os eletrodos), ou suas bandas irão literalmente rir da sua cara. *Procure descobrir a voltagem recomendada pelo fabricante do padrão de tamanho que você usa.
4. Bolhas ou partículas no gel ou nos poços também podem atrapalhar.

Se você tem tido outros problemas com eletroforese de DNA, como bandas pouco intensas, rastros, padrões de tamanho atípicos ou DNA que não sai do poço, dê uma olhada neste "troubleshooting". Ele explica muita coisa!

Será o fim de Sanger?

A genética avançou grandes passos no século XX. Foi somente na década de 1920 que foi demonstrado que o DNA é a molécula portadora da informação genética e, menos de 100 anos depois, é impressionante o quanto descobrimos sobre como esta informação é codificada, traduzida, transmitida e regulada.

Como já falei por aqui, um marco importante na história da genética foi a invenção do sequenciamento de DNA em 1977 – um método que levou o nome do seu inventor, Sanger. Mas o reinado absoluto de Sanger começou a ruir na década de 2000, quando surgiu a próxima geração de sequenciadores (Next Generation Sequencing, NGS), baseados em novos e diferentes princípios químicos, como pirosequenciamento, Solid, Illumina e, mais recentemente, Ion Torrent. A grande diferença está na velocidade e capacidade de sequenciamento, muito superiores a tecnologia anterior. O genoma humano que levou 13 anos para ser concluído com o método de Sanger, agora pode ser sequenciado em apenas um dia. Um salto e tanto, não? E quando o céu parecia ser o limite, uma 3ª geração de sequenciadores já começa a surgir no horizonte, com a promissora tecnologia dos nanoporos.

Parece óbvio que chegou a hora de o método de Sanger sair de linha e pendurar suas chuteiras. Os novos sequenciadores irão eventualmente liderar projetos grandes de sequenciamento de genomas e transcriptomas inteiros. É uma questão de dinheiro. O custo por base sequenciada é bem menor nos novos sequenciadores, mas em compensação eles são menos flexíveis quanto à quantidade de bases sequenciadas, ou você sequencia muitos pares de base de uma vez, ou você não sequencia nada. E por isso, acredito que o Sanger irá cada vez mais assumir um papel secundário, sendo utilizado para preencher gaps em genomas ou em projetos pequenos, como para confirmar construções ou a identidade de produtos de PCR.

Mas, por enquanto, o sequenciamento de Sanger ainda é considerado o “padrão ouro” em acurácia. E para realmente se consolidarem no mercado, o custo para a implementação e manutenção das plataformas de NGS precisa se tornar mais acessível e estas novas tecnologias ainda precisam de otimização e, principalmente, mais validação. O tamanho das sequências produzidas precisa aumentar, o que já vem acontecendo de maneira consistente, e também é preciso desenvolver algoritmos mais precisos para inferir a qualidade das leituras (o que varia conforme a técnica), e para montagem e manipulação da grande quantidade de dados produzida.

Chegamos ao ponto de produzir muito, mas muito mais dados do que somos capazes de processar e, principalmente, explorar. E, mais do que produzir sequenciadores mais velozes, agora é mais importante melhorarmos e validarmos os já existentes e, principalmente, pensarmos em como vamos manipular, interpretar e aplicar todos estes dados para transformá-los em informações úteis.

SHORT TIPS - Quando enzimas de restrição cortam onde não devem

Laboratório de biologia molecular que se preze tem pelo menos meia dúzia de enzimas de restrição no freezer. Elas cortam o DNA, não em pontos aleatórios, mas em sequências específicas, os sítios de restrição. Um grande número destas enzimas já foi identificado e está disponível comercialmente. Cada uma delas reconhece e corta um sítio de restrição diferente. E é justamente por isso que elas são tão úteis. Não importa qual seja a sua aplicação - cortar um plasmídio e/ou gene para clonagem ou a análise do padrão de fragmentos de um genoma – a especificidade destas enzimas é sempre essencial para o sucesso do experimento.

Mas, como nem tudo é perfeito, em algumas condições estas enzimas podem cortar o DNA onde não devem, ou seja, em sequências diferentes do seu sítio de restrição. O nome deste fenômeno é “atividade estrela” (star activity) e acontece quando a reação de digestão do DNA não segue as condições consideradas ótimas para o funcionamento da enzima. Em geral, você estará seguro se seguir o protocolo do fabricante, mas veja abaixo alguns cuidados para evitar este problema, principalmente, ao modificar o volume de reação.

Quantidade de enzima por reação.

Não deve ultrapassar 10% do volume final da reação. A enzima vem em uma solução que contem 50% de glicerol. E mais de 5% de glicerol na reação irá causar atividade estrela. Também é importante respeitar a quantidade de enzima (unidades) por quantidade (ug) de DNA recomendada pelo fabricante.

Tampão.

Use sempre o tampão recomendado, na diluição indicada. Em geral, cada enzima tem um tampão ótimo. E, a não ser que tenham composições iguais, o tampão de uma, não pode ser usado com outras enzimas.

Tempo de digestão.

Eu sei o quanto as incubações “overnight” (de um dia para o outro) são legais e práticas. Mas, por mais que o fabricante diga que a digestão pode levar de 2 a 18 horas, use sempre o tempo mínimo, ou algo mais próximo dele. Digestão longa demais pode resultar na perda de especificidade da enzima.

Contaminação da amostra.

Como já falei antes por aqui e aqui, RNA contaminado é sempre um problema para reações enzimáticas. E com DNA não é diferente. Tenha certeza que sua amostra está pura, sem vestígios de sais, álcool ou outros solventes orgânicos.

Referência:

http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/star_activity.asp#.T1t0szEgeQw

Cola de Mexilhão

Quando você pensa sobre mexilhões, qual a primeira imagem que vem na sua mente? Provavelmente, algum prato a base de frutos do mar, que inclua os suculentos mariscos. Com certeza, quase ninguém imagina que a utilidade dos mexilhões pode ir muito além da cozinha e chegar até centros cirúrgicos, consultórios odontológicos e na indústria naval. Isso por que estes animais tem algo que pode ser muito útil para todas estas áreas.


...continue a ler no Blog do Bioma!

RNAse Free "nas nuvens"

Se você é dependente da internet como eu, todos os dias também deve se deparar com a avalanche de informações que vem assim que damos o primeiro click: notícias do dia (e dos últimos segundos), e-mails, redes sociais, mais e-mails, blogs, revistas, livros, artigos,...É difícil selecionar o que é importante, sem gastar algum tempo com o que não é. A "nuvem de palavras" (“word/tag cloud", em inglês) é uma forma bem interessante de lidar com isso e obter uma boa perspectiva geral do conteúdo de um texto ou site. Funciona assim: a nuvem é formada pelas palavras mais frequentes do texto/site analisado, sendo a relevância de cada palavra indicada pelas cores e tamanho da fonte. Uma idéia simples, mas muito útil. Do tipo que nos faz pensar: “Por que eu não pensei nisso antes?”. Vejam abaixo, a nuvem de palavras do RNAse Free que eu fiz no Wordle (clique na imagem para ampliá-la).

RNA, DNA, sequenciamento, degradação, primer? Quem conhece blog deve concordar que diz muito sobre ele. É claro que a nuvem de palavras não substitui a leitura completa do texto, mas ajuda a encontrar a informação que você procura mais rapidamente...além de ser visualmente mais atrativo do que dezenas e dezenas de páginas indevassadas. Todos os sites (e blogs) deveriam ter uma. Eu vou já providenciar uma nuvem de tags com hiperlinks para o RNAse Free...mas todos ainda terão que continuar lendo os posts (que acharem relevantes) até o fim! :)

Troubleshooting: o que fazer quando o RNA está com a razão 260nm/230nm baixa?

Leitor RNAse Free (por e-mail): "Meu RNA está com muito contaminante, pois a razão 260/230 está bem baixa. Tenho que obrigatoriamente fazer extração por Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, então gostaria de saber se você tem alguma dica de como melhorar a pureza do meu RNA e que não interfira nos microRNAs. Vi que você escreveu sobre um protocolo com cloreto de lítio, você chegou a testar? Funciona?”

Identificando o problema
A contaminação indicada pela razão 260/230 baixa pode ser causada por diferentes compostos. No caso do método do Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, podem ser traços destes compostos ou ainda de sal, álcool ou, dependendo do tecido de origem, polissacarídeos. Eu recomendo você ler suas amostras também a 270 nm e calcular a razão 260/270 que indica contaminação por fenol. Esta razão deve estar em torno de 1.2. Se estiver muito abaixo deste valor, então sua amostra está realmente contaminada com traços do reagente de extração (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio). Mas se não, é mais provável que sejam traços de sal, etanol ou polissacarídeos.


O que fazer?
Para evitar que sua amostra seja contaminada com o reagente de extração de RNA (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio), é preciso tomar muito cuidado na etapa de remoção do sobrenandante (a fase aquosa que contém o RNA e que se forma após a primeira etapa de centrifugação). É um pouco de prática. É preciso remover o sobrenandante sem se aproximar muito da interface. No entanto, é impossível remover todo o sobrenadante sem trazer um pouco de DNA genômico (a nuvem branca entre as fases orgânica e aquosa) e da fase orgânica (rosa, que fica na parte inferior do tubo). Então, nesta hora, é melhor perder um pouco de sobrenadante, mas ter certeza que todo o sobrenandante recolhido não está contaminado. 


Se você quiser tentar salvar suas amostras já contaminadas sugiro que você faça uma nova purificação com Fenol/Clorofórmio seguida de precipitação com etanol/acetato de sódio e lavagem com etanol 70%. Esta nova purificação com solvente orgânico irá remover os traços de fenol/clorofórmio. Mas, novamente, é preciso muito cuidado na remoção do sobrenadante.
Mas se suas amostras estiverem contaminadas com sal ou álcool basta fazer uma nova precipitação (adicionando 2.5 volumes de etanol absoluto e 1/10 volumes de acetato de sódio 3M) e em seguida lavando o pellet com etanol 70%. A maioria das pessoas tem pavor de vortexar os tubos nesta etapa de lavagem. Mas a não ser que seu pellet não seja visível, você deve vortexar gentilmente para lavar bem o pellet e remover o excesso de sais. Eu costumo fazer esta etapa pelo menos duas vezes.


Purificação com cloreto de lítio
Eu sempre faço a purificação com cloreto de lítio em todas as minhas amostras de RNA extraídas com Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio. Funciona mesmo. O RNA fica bem mais limpo e é essencial para amostras que possam estar contaminadas com polissacarídeos, como aquelas extraídas a partir de tecido muscular, por exemplo. No entanto, o cloreto de lítio não precipita de forma eficiente microRNAs. Então, não recomendo que você inclua esta etapa nas suas extrações, já que você tem interesse nesse tipo de RNA.


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Envie suas perguntas na forma de comentários ou por e-mail (blog.rnase.free @ gmail. com) e suas dúvidas poderão dar origem a um post na sessão "Troubleshooting" do RNAse Free.

Controle de qualidade de RNA - Opções “low cost”

Todo cuidado é pouco quando trabalhamos com RNA. Para se manipular este “ácido nucléico de uma fita só”, absolutamente tudo deve ser livre de RNAses, enzimas que estão por toda parte e que podem rapidamente degradar o nosso RNA de cada dia. Além disso, temperaturas elevadas e exposição à UV também podem degradar o RNA. Mas isso já foi discutido por aqui, logo no começo do blog (não é a toa que o nome deste blog é RNAse Free).

Se você quer isolar e identificar mRNAs completos ou quantificar níveis de mRNA por PCR quantitativa ou microarranjo de DNA, é essencial se certificar que a sua amostra de RNA esteja pura e íntegra. Um RNA contaminado pode afetar a eficiência de retrotranscrição. Um RNA ainda que apenas parcialmente degradado pode diminuir a precisão dos resultados ou mesmo arruinar o experimento.

É fácil reconhecer um RNA totalmente degradado através de eletroforese em gel de agarose (veja a amostra 1 na figura abaixo). Mas uma degradação parcial é mais difícil de identificar. Os RNAs 2 e 3 estão ambos íntegros? Com certeza? O RNA 3 parece íntegro para mim, mas o 2 me deixa na dúvida (Observação: o esperado para estas amostras é uma única banda de RNA ribossomal, pois trata-se de RNA total extraído de espécies de moluscos bivalves. Amostras de RNA obtidas de vertebrados, no entanto, devem exibir duas bandas de RNA ribossomal).

Como já falei por aqui, o Bioanalyzer é um equipamento que permite uma avaliação mais precisa da integridade do RNA através de eletroforese capilar. Mas ainda é bem caro e pouco comum nos laboratórios.

Então, como identificar uma degradação parcial de forma, digamos...mais econômica? Eis o “método” que chamo de “Bioanalyzer low cost”. Você deve fracionar sua amostra de RNA por eletroforese em gel de agarose em condições desnaturantes. Eu sigo o protocolo descrito por Masek et al (2005), pois é bem prático e efetivo. No entanto, no lugar do brometo de etídio, se possível, seria melhor usar algum corante mais sensível, como o SYBR Green II que detecta até 500 pg de RNA. A dica está em fazer uma análise densitométrica da imagem do gel usando um software de acesso livre como o Image J. Transformando o perfil eletroforético do RNA em um gráfico de densitometria é mais fácil identificar indícios de degradação parcial do RNA (ao menos para os meus olhos, que não são de águia).

É importante não aplicar RNA em excesso no gel e usar a mesma quantidade para todas as amostras. Usando brometo de etídio, eu não aplico mais de 800 ng (é possível usar ainda menos). Se você usar outro corante, mais sensível, use menos RNA ainda. RNA demais no gel pode resultar em um “rastro” que não necessariamente significa degradação.

E agora, olhando os gráficos ficou mais fácil decidir se amostra 2 tem sinais de degradação? O RNA íntegro (3), com uma única banda, resulta em um gráfico em formato de sino estreito, quanto maior a “barriga” do sino, maior o indício de degradação. Na amostra 1, esta “barriga” é bem grande, indicando seu alto grau de degradação. Na amostra 2, além do pico principal, observamos dois picos menores, indicando uma possível degradação parcial. 

Independente de analisar o perfil densitométrico da imagem ou não, é importante que a eletroforese tenha sido feita em condições desnaturantes, para evitar a formação de estruturas secundárias que no gel apareceriam como múltiplas bandas que poderiam ser confundidas com degradação. 

É claro que este "método" não é preciso e sensível como o bioanalyzer. É apenas uma dica para tornar a visualização de degradação mais clara e fácil!

Outro método acessível (baseado em PCR) para avaliar a integridade de amostras de RNA de forma mais acurada é a chamada razão 5’/3’. Mas este fica para o próximo post. Até lá! 

Troubleshooting - Sequenciamento de DNA

 Uma leitora, após várias tentativas de sequenciar alguns clones, me pediu algumas dicas sobre sequenciamento de DNA. Na minha experiência, as principais causas de problemas durante o sequenciamento estão relacionadas ao preparo das amostras. Vamos à discussão sobre algumas delas! O texto não é longo, mas se estiver com pressa, não deixe de olhar o checklist no final do post.

Purificação do DNA.

É muito importante utilizar um bom método de purificação de DNA, de preferência, um kit comercial adequado para esta aplicação. Purificar DNA com métodos “caseiros” pode funcionar, mas dificilmente vai remover todos os contaminantes que podem inibir a reação de sequenciamento. Uma maneira de verificar a presença de contaminantes em sua amostra purificada é determinar o seu espectro de absorbância. Como já falei por aqui, a razão entre as absorbâncias a 260/280 é um bom indicador de contaminação por proteínas, enquanto que a razão 260/230 é um bom indicador de contaminação por outros compostos orgânicos e por sais.

Para evitar contaminantes inibidores, deve-se usar água ultrapura para ressuspender ou eluir o DNA. Caso esteja usando um kit, verifique se o tampão de eluição não contém EDTA ou sais. O EDTA é um quelante de íons bivalentes e inibe a reação de sequenciamento ao sequestrar os íons de magnésio essenciais para a atividade da DNA polimerase.

Quantificação de DNA

Adicionar muito DNA pode inibir a reação, alterar a migração das amostras nos capilares ou mesmo bloqueá-los! Por mais que pareça pouco, adicione a quantidade de DNA recomendada pelos técnicos ou pelo kit de sequenciamento, que pode variar de acordo com o tipo de amostra (produto de PCR, DNA plasmidial, etc). No entanto, colocar menos DNA que o recomendado também não é bom e resultará em sinais de fluorescência muito baixos.

Para não errar por excesso e nem por escassez, é importante quantificar de forma precisa as amostras que serão sequenciadas. Se você tem poucas amostras, é fortemente recomendado a quantificação por eletroforese em gel de agarose. Aplique uma alíquota da sua amostra e em paralelo um fragmento de concentração conhecida e de tamanho próximo ao da sua amostra. Após a corrida, compare a intensidade das bandas por meio de um software de análise imagens como o ImageJ e estime a concentração da sua amostra com base na comparação entre as intensidades dos dois fragmentos. A maioria dos padrões de DNA indica em seus datasheets as quantidades relativas de pelo menos alguns dos seus fragmentos. Além de permitir a quantificação mais precisa do fragmento a ser sequenciado, através da eletroforese também é possível verificar se sua amostra não está degradada e detectar fragmentos contaminantes, como bandas de PCR não específicas, dímeros de primers, DNA genômico ou RNA, que condenariam o sequenciamento ao gerarem cromatogramas com picos sobrepostos.

Quantidade e integridade do primer

O primer é tão importante quanto a amostra. Adicione sempre a quantidade recomendada. Pouco primer também resultará em sinais de fluorescência baixos. A quantificação e a qualidade de purificação do primer dependem do fabricante, mas certifique-se que suas diluições estão corretas. Um dos possíveis problemas é o primer estar degradado. Para evitar a degradação guarde-os conforme o recomendado (-20ºC) e prepare alíquotas diluídas para reduzir os ciclos de descongelamento e congelamento da solução estoque. Nunca descongele seus primers aquecendo-os ou a temperatura ambiente, mas sempre em gelo. Em caso de suspeita de degradação, teste-os em um PCR com uma amostra controle, bem purificada.  

Especificidade do Primer

Se você está sequenciando um gene clonado em um vetor plasmidial, provavelmente, irá usar um primer já padronizado para este vetor. Se você desenhou primers específicos para o seu alvo, certifique-se que eles sejam específicos - que não se liguem em outras regiões do seu DNA template - e que não formem estruturas secundárias, como já discutido aqui.

Formação de estruturas secundárias no DNA alvo.

Isso pode ocorrer principalmente quando o DNA alvo é rico em GC. A formação dessas estruturas impede a incorporação de nucleotídeos e bloqueia o prosseguimento da reação de sequenciamento.

Recomendo a leitura deste site para aqueles que quiserem se aprofundar mais. Nele, são apontadas as causas para falhas específicas no sequenciamento.

Se tiver perguntes ou quiser sugerir a inclusão de mais algum ponto  esta lista, deixe um comentário.

Troubleshooting

Depois de muito tempo longe do blog, resolvi tirar a poeira inaugurando uma nova categoria de posts no RNAsefree: Troubleshooting.

Como recebo muitas perguntas por e-mail, frequentemente repetidas, achei que seria mais proveitoso publicar as perguntas e respostas no blog, pois a dúvida de um pode ser a mesma de muitos.

O nome "troubleshooting" faz referência ao tópico de solução de problemas que vem em todos os manuais de kits e reagentes de biologia molecular (e que todos deveriam ler, na maior parte das vezes são realmente úteis).

Deixem suas perguntas na forma de comentários ou escrevam para o e-mail: blog.rnase.free @ gmail. com

E suas dúvidas poderão dar origem a um post no blog!

Em breve, publicarei o primeiro post troubleshooting sobre preparo de amostras para sequenciamento de DNA pelo método de Sanger.

OBS.: Os nomes dos autores das perguntas assim como informações sobre seus projetos não serão publicados.