Só para fechar esta questão dos primers: um guideline no site da Premier Biosoft (a empresa do netprimer e do primerpremier) me ajudou bastante fornecendo os valores toleráveis de deltaG para cada uma das possíveis estruturas secundárias para os primers em questão. O deltaG (variação de energia livre) indica a quantidade de energia necessária para romper com a estutura secundária e é utilizado como uma medida da estabilidade destas estruturas. Quanto mais negativo for o deltaG, mais estável é a estrutura e, portanto, piores são os efeitos no PCR! Mas, não é preciso ficar desesperado como eu fiquei quando o programa acusar estruturas em todos os seus primers. Se o deltaG for baixo, provavelmente, aquela estrutura não vai se manter na temperatura de anelamento dos primers durante o PCR e não vai interferir na eficiência da reação de amplificação. Por enquanto, meus primers estão ok, embora nem todos estejam funcionando (mas acredito que por outros motivos).
Para saber mais e conhecer os valores de deltaG toleráveis em cada caso: http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html
No próximo post, vou falar sobre outro tipo de "design" :)
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