Bioinformatics can be that cool

Ainda não aprendi a fazer todas as análises de bioinformática como eu queria, leia-se da forma mais prática, mas estou voltando as boas com a área. É muito bonito depois do trabalhão que dá chegar até um simples arquivo FASTA, ver que aquela simples sequência de nucleotídeos codifica uma proteína interessante, tem um domínio altamente conservado (como na foto abaixo) e vai ajudar a entender um pouco mais sobre o organismo que estudamos.

Domínio FRED (NCBI)

A quantidade de informação que podemos extrair de uma sequência de DNA ou proteína usando ferramentas de bioinformática e graças a internet (a 8ª maravilha do mundo) é absurda! Dois exemplos:

O NCBI tem um banco de dados de domínios conservados onde é possível buscar na sequência de uma dada proteína a existência de algum domínio conservado. Em se tratando de uma sequência de nucleotídeos, basta traduzi-la usando por exemplo a ferramenta de tradução do expasy  ou mesmo o Bioedit. Mas existem 6 possíveis traduções: 3 frames em dois sentidos. Se biblioteca de cDNA é direcional (as sequencias foram clonadas no sentido 5'3'), 3 possibilidades já podem ser eliminadas, pois conhecemos o sentido da sequencia. Entre as 3 possibilidades remanescentes, a mais provável é aquela sem um STOP codon, ou com um maior trecho sem STOP codon, mas na dúvida, não custa nada testar as três.

Como resultado, tem-se um relatório detalhado dos possíveis domínios conservados presentes na proteína. Além de informações como o valor e o score para avaliar a relevância da similaridade encontrada, é exibido um esquema indicando onde na sua sequencia está o domínio, o alinhamento de maior similaridade com um dos membros deste grupo de domínios, além de um link para a página do mesmo com várias outras informações interessantes, como estutura tridimensional, uma descrição funcional e citações na literatura. Para ver um exemplo, veja a página do domínio FRED, que achei em um dos meus clones. Muito maneiro.

Ainda vou ficar devendo um post dedicado ao Blast2GO. Eu sou fã do Blast2GO! É realmente user-friendly. Agora eles estão no twitter, pena que eu não estou mais neste miniblog irritante. Mas a segunda ferramenta interessante e que só fui usar recentemente via Blast2GO é o banco de dados Kegg Pathways que agrupa vias de reações e interações moleculares anotadas manualmente. O BlastGO identifica o código Kegg das enzimas presentes entre as sequencias anotadas e com isso é possível baixar os mapas das vias de referência das quais a enzima participa. Muito, muito maneiro também.

Update 20/09/2009:
O banco de dados de proteínas do NCBI oferece vários formatos para acessar uma dada proteína, um deles é chamado de "graphics" e é praticamente o google earth das proteínas. Mas muito mais interativo, você pode passear pelas ruas que quiser, abrir e fechar portas, olhar pela fechadura, etc, uma realidade bioquímica virtual!  

Homologia ou Similaridade? Nem tudo é o que parece.

Um dos principais objetivos da análise de sequências de DNA e proteínas é identificar sequências homólogas. Mas o que são exatamente sequências homólogas? Quando temos uma sequencia desconhecida que queremos identificar associando-a a uma família de proteínas de funções conhecidas, comparamos esta sequência com as dos bancos de dados utilizando um algoritmo como o BLAST. Em geral, como resultado obtemos uma lista, às vezes, grande de resultados. Seriam todas estas sequências "homólogas" a nossa sequência "problema"?

Em se tratando de análise de sequências de DNA e proteínas, muitos usam o termo homologia para expressar o que na verdade é similaridade. O BLAST e algoritmos semelhantes analisam a similaridade entre as sequências e nos dão uma lista de resultados contendo diferentes genes que apresentam graus decrescentes de similaridade com a nossa sequência problema. Similaridade é simplesmente uma forma de expressar o quanto duas sequências são parecidas e, por isso, faz sentindo dizer que a nossa sequência apresenta maior similaridade com o gene X do que com o gene Y; ou que duas sequências possuem 80% de similaridade, por exemplo.

No entanto, homologia é um conceito biológico essencialmente qualitativo. Homologia significa origem evolutiva comum. Duas sequências são homólogas quando se originaram de um ancestral comum. Assim, ou duas sequências são homólogas, ou não. Não existem seqüências com, por exemplo, 80% de homologia. Ou é, ou não é! E esta informação, o BLAST não dá.

Então, para que serve a similaridade medida pelos BLASTs da vida? E como podemos identificar a homologia?

Ninguém disse que similaridade não serve para nada! Sendo uma medida numérica pode ser relacionada com probabilidade e nos ajudar a inferir homologia, mas não sem critérios. É verdade que quanto maior a similaridade entre as sequências, menor a probabilidade de que ela tenha ocorrido ao acaso, sendo mais provavél que as duas tenham um ancestral comum e sejam, portanto, homólogas.

Então, genes homólogos apresentam sempre alta similaridade? A similaridade é evidência absoluta de homologia?

Você diria que 20 sequências de espécies diferentes que apresentam apenas um aminoácido em comum são homólogas? Seguindo o raciocínio acima, não. Mas não é verdade para a proteína ribossomal L36. Para a função desta proteína, mais importante que a sequência é a estrutura! Apesar de as proteínas L36 de diferentes espécies diferirem muito na sua sequência de aminoácidos, apresentando apenas um aminoácido conservado, a sua estrutura é conservada.

Portanto, nem todos os genes homólogos apresentam altos valores de similaridade. E a similaridade estrutural é uma informação valiosa que deve ser também acessada, sempre que possível. A porcentagem de similaridade não é a única informação que temos que avaliar para inferir a homologia entre dois genes. Nos casos em que se observa baixa similaridade, devemos avaliar alguns outros aspectos:

* Existe uma região onde a similaridade é maior entre as duas sequências? Esta região é funcionalmente importante? Por exemplo, está localizada no sítio ativo da enzima ou em um domínio de ligação?

* Os poucos aminoácidos conservados são essenciais para o funcionamento da proteína?

* Os aminoácidos não conservados apresentam as mesmas características físico-químicas? E assim poderiam, apesar de diferentes, exercerem o mesmo papel na proteína?

Um exemplo, são as proteínas que se ligam a calmodulina (uma sensora dos níveis intracelulares de cálcio). Estas proteínas se ligam a calmodulina através de um domínio que não apresenta uma sequência conservada, mas uma estrutura bem definida: alfa hélices anfipáticas, onde aminoácidos hidrofílicos estão localizados em um lado e os hidrofóbicos, no outro.

Concluindo, similaridade não é sinônimo de homologia, mas constitui um dado importante para inferirmos homologia e deve ser analisada com critérios. Estes critérios nos ajudam a determinar a significância biológica da similaridade observada cuja a primeira impressão, ás vezes, nos engana! Mesmo na biologia, nem sempre tudo é o que parece...

Referência:
Eugene V. Koonin, Michael Y. Galperin (2002) Sequence-Evolution-Function: Computational Approaches in Comparative Genomics.Kluwer Academic Publishers

 

Similarity Page at NCBI website

Diário de uma mestranda com a corda no pescoço - 08/2009

Ok, ainda não estou tão com a corda no pescoço. Exagerei, como sempre! Mas estou quase lá. Digamos que a corda já está no pescoço, mas ainda não começou a apertar. Meu prazo é março. Mas para fazer a seleção de doutorado em dezembro, preciso ter a dissertação escrita. Ainda tenho que fazer uma disciplina de 120 horas, extrair, sequenciar e analisar quantos clones eu puder e...escrever a bem dita dissertação! Que ainda está nas primeiras páginas...mas as primeiras linhas são as mais difíceis e estas já foram. Mas é claro que ela ainda vai ser reescrita um milhão de vezes até chegar a versão final, não tenho dúvidas. Ao menos, encontrei finalmente um kit para extração de plasmídios em placas de 96 poços com pronta entrega. Não vou ter que esperar 3 meses, como de costume para muitos kits e reagentes, no Brasil. E vou poder extrair 100 plasmídios por dia sem entrar em coma depois! Ainda estou tentando me virar com a bioinformática. Na verdade, não tenho investido muito tempo nisso. Tenho que correr mais atrás, mas é difícil, acho que vou mesmo ter que colocar Linux. Estou me sentindo analfabeta em bioinformática. Em paralelo, este semestre vou trabalhar no RACE para o p53 e MXR usandoo protocolo que já funcionou muito bem para actina e também vou voltar aos hidden breaks que, admito, tinha largado de mão. Já se foram um ano e meio de mestrado e e se foram muito rápido!

EST analysis: o começo! (*)

Bom, este post não tem o objetivo de ser um passo-a-passo de como usar os softwares para analisar ESTs, até por que eu ainda estou aprendendo e seria um livro, não um post. A idéia é descrever teoricamente a principais etapas, que podem ser feitas por diferentes softwares. É claro, este não é um processo rígido, depende de uma série de fatores como de com que espécie se trabalha e principalmente de quais são os objetivos do trabalho.

1) Trimming

O primeiro passo é fazer uma "limpeza" (trimming) das seqüências. O sequenciamento frequentemente gera alguns trechos de má qualidade, em geral, no ínicio e no final do fragmento, ou seja, onde algumas bases não puderam ser determinadas ou não o foram com muita precisão. Estes trechos devem ser removidos para não interferir nas etapas seguintes. Além disso, frequentemente, flanqueando a sequência do inserto, ou seja, do cDNA que é o que de fato interessa, há sequências de adaptadores e do vetor utilizados. Estes trechos também devem ser removidos para que no final desta etapa haja apenas a sequência do inserto com um nível de qualidade aceitável.

De fato, a presença de sequências contaminantes (vetores e adaptadores) nas sequências depositadas nos bancos de dados tem se tornado um problema crescente, gerando uma série de problemas muito bem discutidos aqui. Diante disso, a NCBI criou um software online chamado VecScreen que detecta contaminação de sequencias exógenas submetendo a sequência de inetresse a um BLAST contra um banco de dados de contaminantes (UniVec)

No entanto, apenas uma sequência pode ser analisada por vez e o programa apenas indica onde começa e termina as sequencias contaminantes. Ou seja, não serve para identificar e remover estes contaminantes de um grande número de sequências. Para isso, existem alguns softwares disponíveis: SeqClean (Free, só roda em Linux), LUCY2 (Free, roda em windows), DNA Baser (pago, 60 dias grátis para testes), entre outros. Estes mesmos softwares também pode ser utilizados para remover os trechos de baixa qualidade.

Update 19/09/2009. Antes se seguir para a próxima etapa, é importante também "mascarar"(masking) regiões de baixa complexidade e de repetições que poderiam interferir no agrupamento, assim como nas etapas seguintes. O "masking" consiste em substituir estas regiões por N (base não determinada) e assim elas não serão consideradas no clustering, assembly, BLAST, etc. Um dos meios de se fazer isso é pelo site RepeatMasker.

2) Clustering e contigs assembly

"Clustering" consiste em dentro do grupo de sequências, agrupar aquelas que se sobrepõe e que portanto são derivadas de um mesmo fragmento maior. Em uma segunda etapa, com base nestas sobreposições, estas sequências são agrupadas em contigs (sequencia contínua consenso que representa o fragmento maior de onde as diferentes sequencias são derivadas).Vários softwares fazem este trabalho: TGI Clustering tools (TGICL) e DNA baser, por exemplo.

3) Gene onthology: BLAST2GO

Agora que temos as sequencias "limpinhas" e organizadas, o que fazer com elas? Bom, isso depende do objetivo do trabalho! No meu caso, devo fazer um BLAST para anotar o máximo de sequencias possível. Para tanto, devo utilizar a plataforma Blast2GO que além de fazer este trabalho ainda tem várias outras ferramentas interessantes! Como eu tive uma aula com uma das criadoras deste software, Dra Ana Conesa, embora ainda não o domine, tenho um pouco a mais a dizer sobre e fica pro próximo post!


*Post sujeito a atualizações!

EST sequence analysis: e agora?

Um projeto de transcriptoma começa tradicionalmente com a geração de bibliotecas de cDNA, como já discuti extensivamente por aqui. Agora que superei esta etapa, começa o que para mim é um desafio um pouco maior: a análise das seqüências obtidas. Um desafio por que (1) eu nunca fiz isso antes (2) por que por mais que se leia livros, artigos e tutoriais dos softwares, isso só se aprende mesmo com a prática e (3) por que são centenas de sequencias e por tanto uma grande quantidade de dados são gerados. Este último fator é um "problema" crescente na biologia. Com técnicas cada vez mais modernas e rápidas, uma grande quantidade de dados tem sido gerada e para lidar com eles, ou seja, para extrair informação deles, somente os bioinformatas podem nos ajudar! E de fato, o tem feito. Tanto, que uma das minhas dificuldades tem sido: que programa usar? E a resposta esta geralmente associada a "free download", uma vez que os bioinformatas sabem valorizar bem seu trabalho. No entanto, não é fácil para os "não-bioinformatas" aprenderem a usar os vários softwares de que precisam de forma crítica, entendendo de fato o que estão fazendo, o que significa cada parâmetro dentro do processo em questão e não apenas reproduzindo uma série de comandos pré-estabelecidos por alguém.

Embora eu não tenha experiência com isso, sempre tive interesse e se aparecer qualquer curso , disciplina ou conversa fiada sobre o assunto, eu estou dentro! No entanto, estou conformada com a idéia de que vou ter que ser um pouco autodidata para aprender tudo isso, como muitas vezes temos que ser na vida acadêmica, o que não é realmente um problema. Assim, após um jejum de posts, resolvi escrever este, mais uma vez, para me ajudar a ordernar minhas idéias.

Bom, os dados que eu tenho em mãos são um grupo de sequências obtidas de clones selecionados aleatoriamente das bibliotecas de cDNA. Estas sequencias foram obtidas através de reações de sequenciamento a partir de amostras de DNA plasmidial usando um primer universal específico para o plasmidio no qual as bibliotecas foram construídas. E como resultado, tem-se um grupo de (na ordem de centenas) sequencias de nucleotídeos e os respectivos cromatogramas, mostrando o sinal para cada base.

Como saber o que estas sequencias significam? Que genes codificam? Em que processos estão envolvidos? Todas as sequências são de genes diferentes? Existem sequencias de regiões diferentes de um mesmo gene? Qual a redundância das sequências? Qual padrão de códons usado pelo organismo? É possível identificar microsatélites, SNPs ou outros polimorfismos?

Todas estas perguntas somente podem ser respondidas através de ferramentas computacionais! E, por isso, ao invés de ter medo desses programas, temos mais é que agradecer que eles existem! E com isso em mente, respirar fundo e aprender a usá-los, pois eles estão aí para nos ajudar.

No próximo post, vou descrever as principais etapas do processo de análise e identificação de EST (Expressed Sequence Tags) geradas a partir de bibliotecas de cDNA. Até lá!

Onde colocar o brometo?

O post desta vez vai ser rapidinho, apenas para comentar algo que observei por experiencia propria e que para muitos talvez seja ja fato ha muito conhecido. A questao è de que forma usar brometo de etidio para corar geis de agarose de amostras de DNA? Ao longo dos anos, usei as 3 formas que eu conheço: (1) apos a corrida, colocar o gel em uma soluçao de brometo de etidio, (2) adicionar o brometo de etidio ao tampao de amostra e (3) adicionar o brometo de etidio ao gel de agarose, quando este começa a polimerizar. Bom, ao meu ver, a pior forma è a primeira. As bandas nunca ficam bem definidas, além de que leva mais tempo para corar e depois para descorar o excesso. O método numero 2 è ok, as bandas ficam bem definidas, no entanto, colocando o brometo no gel alèm de gerar uma boa definiçao, na minha experiencia, è bem mais sensivel! Esta fazendo muita diferença no meu caso. O unico contra è ter que manipular brometo bem concentrado sempre (soluçao de 5mg\ml), contaminar vidraria e cuba de eletroforese com o bendito, alèm de que se gasta mais brometo desta forma, mas ao menos è bem barato! Fica a dica.

Clonagem III: e as bibliotecas?

Esclarecidos alguns pontos no post anterior...a dificuldade da clonagem de bibliotecas de cDNA é que se tem em mãos uma mistura complexa com seqüências de diferentes tamanhos...o que torna impossível saber ao certo a razão molar e calcular o quanto se deve adicionar de insertos. O jeito é ir tentando diferentes quantidades. Outra questão é que quanto menor o fragmento, mais eficientemente ele será clonado! Uma grande pedra no sapato quando se quer construir bibliotecas full lenght com fragmentos maiores que 1 kb. Por isso, é importante adicionar algumas etapas para remover do cDNA os fragmentos de menor tamanho, como já discuti aqui antes. Aliás, tudo favorece os fragmentos pequenos: PCR, ligação por T4 DNA ligase e a transformação de fragmentos pequenos são sempre mais eficientes e podem introduzir bias e reduzir a freqüência de fragmentos maiores.

Quando clonando apenas um gene específico, obtendo-se 20% de recombinantes, já é o suficiente: pegando 10 colônias, em pelo menos duas, você encontrará o seu clone! Mas, em uma biblioteca de qualidade, espera-se pelo menos 90% de clones recombinantes. Caso contrário, não vale a pena prosseguir com um “random sequencing”, ou seja, pegar 1000 clones, extrair o plasmídio e seqüenciar para achar apenas 200 sequencias que ainda por cima podem ser repetidas...é jogar dinheiro fora! Por isso, todo este sistema deve ser otimizado para estar funcionando muitíssimo bem: as enzimas de restrição, as etapas de purificação, a remoção de fragmentos pequenos, reação de ligação e transformação! Aliás, me convenci de vez: bibliotecas só transformando por eletroporação! Tentei transformar por choque térmico usando células “super”competentes comerciais, especiais para bibliotecas e para fragmentos grandes, etc...o controle, pUC18, plasmidio pequenininho, funcionou super bem, na ordem de 10(9), mas para as bibliotecas, não. O máximo que consegui foi na ordem de 10(4). Com a eletroporação, consegui um aumento de duas ordens de grandeza 10(6), sendo que não usei toda a minha reação de ligação.

Bom, isso tudo não é o fim do mundo, não é impossível – eu tenho 1 bilhão de papers no meu computador - só é mais difícil...mas a gente chega lá! :-)

Bom, mesmo eu tendo tratado o assunto clonagem meio superficialmente, ficou muitíssimo longo e chato, praticamente, um desabafo! Se você chegou até aqui ou é muito meu amigo ou provavelmente tem um interesse maior no assunto e recomendo a leitura deste capítulo de livro:

“Recombinant DNA technology and molecular cloning”
Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison
Outros dois capitulos deste livro estao disponiveis no link:
http://www.blackwellpublishing.com/allison/contents.htm

Apesar de ser um pouco básico é bem completo (e longo!).

Clonagem II

Bom, depois de duas semanas, volto ao assunto delicado! O protocolo mais tradicional para clonagem molecular consiste em ligar os dois fragmentos de DNA utilizando a enzima T4 DNA Ligase que catalisa ligações fosfofodiéster, ou seja, catalisa a ligação covalente entre dois fragmentos de DNA. Mais recentemente, começou-se a usar um sistema de clonagem por recombinação (mediado por uma enzima recombinase), mas este sistema não é ainda amplamente utilizado talvez pelo preço ser ainda meio salgado além de estar disponível apenas por duas empresas. Eu tive uma má experiência com um destes kits no passado, mas como eu acho elegante (principalmente, o kit que eu nunca usei), vou falar um pouco sobre ele num próximo post.

Antes da clonagem, em paralelo, deve-se preparar os insertos (o que se deseja clonar: DNA genômico, cDNA, um gene específico, etc) e o vetor que pode ser de diferentes tipos, mas aqui falarei sobre vetores plasmidiais, que são os únicos com os quais já trabalhei. Muito resumidamente, isso consiste em digerir o plasmídio e o inserto com as mesmas enzimas de restrição a fim de obter terminações complementares para então ligá-las por meio da T4 DNA Ligase. A clonagem pode ser direcional ou não. Clonagem direcional significa que o fragmento de DNA será inserido no plasmídio em apenas um sentido. Para isso, o inserto pode ser digerido com duas enzimas diferentes: por exemplo, EcoRI cortando na extremidade 5’ e HindIII, na extremidade 3’. Digerindo o plasmídio com as mesmas enzimas, haverá apenas uma orientação possível para a ligação do inserto, aquela onde as extremidades são complementares. Discutirei aqui alguns pontos que considero mais problemáticos em toda a seqüência experimental relacionada a clonagem molecular.

Digestão por enzima de restrição

Se a digestão não for eficiente, a clonagem também não o será. Se os insertos não estiverem corretamente digeridos, não serão ligados ao vetor. Outro possível problema pode surgir quando se adiciona muita enzima ou se incuba a reação por muito tempo. Nestes casos, a enzima de restrição pode apresentar atividade “star” que consiste em clivar seqüências não específicas. Para a maioria das enzimas, após 2 horas, mais de 90% da atividade enzimática foi perdida, então, não vale a pena fazer digestões muito longas ou overnight.

A escolha das enzimas de restrição também é importante, mas depende do que se está fazendo. No meu caso, estou clonando uma mistura de diferentes cDNAs nos quais foram adicionados adaptadores de seqüência conhecida (contendo sítios de restrição escolhidos) em ambas as extremidades. Neste caso, deve-se usar uma enzima que reconheça um sítio bem incomum, para evitar cortar as seqüências de cDNA que se deseja clonar e digerir apenas os sítios presentes nos adaptadores. Existe um site onde se pode checar a freqüência de alguns sítios de restrição nos genomas de várias espécies, mas infelizmente, não estou achando o link (se achar, posto aqui). Se objetivo é construir uma biblioteca genômica, deve-se escolher a enzima também com base na freqüência de ocorrência do seu sítio no genoma, para que então se obtenha fragmentos da faixa de tamanho desejada para clonagem. Se a seqüência do inserto é conhecida, como no caso de uma subclonagem, pode-se checar que enzimas o cortam no webcutter.

Preparo do vetor

Em particular, a digestão do vetor plasmidial é extremamente importante. Se a digestão não for completa, moléculas de DNA plasmidial circulares permanecerão e causarão muita dor de cabeça: muitos PCRs e “minipreps” inúteis. Estas moléculas não gerarão clones recombinantes durante a reação de ligação, pois estão fechadas (circulares) e na próxima etapa, quando se usa os produtos da ligação para transformar células bacterianas, estas moléculas de plasmidio “vazios” (sem um inserto dentro) irão gerar muitas colônias! Existem formas de se diferenciar as colônias que contém inserto das que não contém, pois algum “background” (plasmidios não digeridos) sempre haverá. O sistema mais comum é a seleção azul/branco (“blue/White screening”). Que é bastante usado e que não vou explicar aqui para não me prolongar ainda mais (quem quiser saber mais, clique no link).

Um procedimento muito comum é tratar o plasmidío após digerido com uma fosfatase para remover o fosfato 5’ e assim impedir que o plasmídio “recircularize”. Em paralelo, deve-se fosforilar o inserto. Para reduzir ainda mais o background, também é interessante, fracionar o plasmídio digerido por eletroforese em gel de agarose e, então, excisar e purificar a banda referente ao plasmídio digerido, uma vez que o mesmo não digerido corre no gel em um padrão diferente como se tivesse um tamanho maior.

E por fim, pode-se avaliar o background do vetor antes de realizar a ligação. Isto pode ser feito, fazendo uma transformação com uma pequena alíquota do vetor pronto para clonagem: quanto menos colônias, melhor! E é claro, ao fazer a ligação, fazer também um controle negativo sem inserto para avaliar o quanto dos plasmídios “recircularizaram” durante a reação.

Eficiência da Ligação

Vários fatores podem influenciar a eficiência da T4 DNA Ligase. Primeiramente, como em toda reação enzimática, é importante que os fragmentos de DNA estejam bem purificados, livres de contaminantes protéicos, fenólicos, sais, enfim, só DNA e água! Em segundo lugar, a T4 DNA ligase é dependente de ATP. Em algumas enzimas, o ATP já está presente no tampão. Em outras, se adiciona separadamente. No entanto, ATP não é muito estável e se o tampão já é um pouco velho, pode ser uma boa suplementar a reação com um pouco de uma solução nova de ATP. A temperatura ótima da T4 DNA Ligase é de 25ºC, no entanto, a temperatura a ser usada deve ser um meio termo entre a melhor temperatura para a enzima e para o anelamento das seqüências (overhangs ou bluntends) do plasmidio com o inserto.

E....o mais importante: a razão molar inserto:vetor! Para garantir que os insertos sejam ligados aos plasmídios e reduzir a ligação do plasmídio vazio, na reação, deve haver um excesso de moléculas de inserto! Esta razão pode ser de 2:1, 3:1...ou seja, duas ou três moléculas de inserto para cada uma de plasmídio. A melhor razão é determinada experimentalmente. No entanto, não adianta simplesmente colocar 50 ng de plasmídio e 100 ng de inserto, pois a quantidade em ng a ser adicionada para se atingir uma determinada razão I:V depende do tamanho dos fragmentos e existe uma fórmula para se calcular o quanto em ng se deve adicionar para se obter uma determinada razão molar, conhecendo-se o tamanho plasmídio e do inserto.

(continua....)

Clonagem: um caso de amor e odio

Ok. Depois de respirar fundo, resolvi escrever aqui sobre clonagem molecular (de genes), algo com o que estou trabalhando no momento. Apesar de o principal objetivo deste blog ser eu discutir técnicas que utilizo no meu mestrado, eu tenho fugido um pouco do assunto, ou só falo das técnicas que vou usar futuramente, pois a verdade é que me estressa um bocado escrever sobre problemas AINDA não resolvidos! Ainda mais clonagem, com quem tenho uma longa história de amor e ódio e que me persegue (ou eu a persigo) desde que comecei a trabalhar com pesquisa, na minha primeira iniciação científica, há...6 anos!!! (nossa! não tinha me tocado que fazia tanto tempo!)

Mas isso é assunto para mais de um post. Então, vou começar com um post mais básico sobre o assunto, para então chegar onde quero (nas questões que me tiram o sono hehehe) A primeira vista, a clonagem molecular é um processo bem simples. Um simples corta e cola, como resumido no esquema abaixo que mostra a clonagem de um gene (GFP) em um vetor plasmidial. E é realmente só isso: a inserção de um fragmento de DNA (inserto) em um vetor, outro fragmento de DNA, porém com capacidade de se replicar no interior de uma célula hospedeira e assim produzir muitas cópias de si mesmo e por tabela do fragmento nele clonado. O vetor pode ser um plasmídio, um fago ou ainda um BAC (cromossomo bacteriano artifical) ou YAC (Cromossomo artificial de levedura), estes dois últimos para clonagem de fragmentos muito grandes.

>>> Mas por que clonar? <<<


Por milhares de motivos!
- Para isolar e sequenciar um gene particular

- Para expressão da proteína em um sistema biológico (bactérias, leveduras ou mesmo células de mamíferos) clonando-se o gene em um vetor de expressão adequado. Com isso, pode-se obter quantidades suficientes de proteína para estudos estruturais, bioquímicos ou o que mais interessar. Ou realizar estudos funcionais, expressando a proteína nas células de interesse de forma controlada, em um determinado contexto.

- Para fazer construções diversas, como por exemplo, conjugar uma proteína à GFP para estudos de localização celular da mesma ou ainda construir proteínas mutantes.

- Para sequenciamento do genoma de organismos, através da construção de bibliotecas genômicas.

- Para caracterização do transcriptoma de um organismo, através da construção de bibliotecas de cDNA (DNA complementar ao RNA, sintetizado por retrotranscrição).

- E mais 995 motivos que não me lembro agora...

Portanto, uma vez que se tenha um gene clonado, isolado em um vetor, pode-se brincar com ele de diversas formas. Como se conhece as sequências que o flanqueiam no vetor, é possível sequenciá-lo facilmente utilizando os primers adequados. No próximo post, começarei a discutir por que a simples ligação de dois fragmentos de DNA pode não ser tão simples assim....ciao!

Blog em crise e o caso "Ruth de Aquino"

Está difícil escolher sobre o que escrever no próximo post, não por falta de idéias, mas por excesso! Nas últimas semanas, baixei váááários artigos interessantes sobre assuntos que gostaria de discutir aqui. A maioria...mentira, todos são sobre genética molecular: controle espacial da expressão gênica, redundância genética, long non coding RNAs, transferência lateral de genes, além de alguns papers sobre o uso de técnicas moleculares na ecologia e na ecotoxicologia e também algumas questões mais metodológicas sobre clonagem e outras coisas que tenho feito...afe, eu realmente gosto de genética! Hoje estou mais certa disso do que quando eu fazia o bacharelado de genética hehehe

Bom, mas eu queria comentar sobre uma reportagem publicada na revista época de autoria da Sra. Ruth de Aquino, redatora chefe da revista em questão: “O besteirol na ciência é melhor que no senado - Ler sobre pesquisas científicas de universidades respeitadas é uma receita certa para dar risada.” Eu não leio esta revista, mas infelizmente muita gente a lê. Fiquei sabendo sobre a reportagem nos blogs discutindo ecologia e brontossauros em meu jardim. A autora tenta ridicularizar a ciência através de argumentos fracos e resumindo-a a meia dúzia de estudos de meia tigela que infelizmente existem por aí. O problema é que muita gente lê esta bendita revista e nem todos os leitores são críticos o suficiente para perceber as falácias na reportagem. Mas isso tudo me faz pensar em como ainda há uma grande carência de divulgação científica digna no Brasil, de meios que discutam e levem a ciência até a sociedade, até as pessoas que não são cientistas e que não estão na universidade, mas que financiam o que é feito dentro dela. A ciência não é apenas para os cientistas e produz conhecimento que é do interesse de todos. Acho que é obrigação de quem está numa universidade pública e fazendo ciência com verbas públicas dar este retorno a sociedade. E tendo como exemplo a reportagem citada, a primeira lição que eu acho que a ciência tem a ensinar as pessoas em geral é a serem críticos. Quando se lê ou assiste qualquer coisa, antes de tomá-las como verdade, temos que ser críticos e questionar os argumentos mostrados (quando existem!). Pensar e questionar antes de se deixar convencer. Não é por que está na revista época, ou na revista X ou na TV que são sempre informações corretas. Em relação à ciência, então, é onde mais se fazem interpretações grosseiramente erradas...

Eu tenho visto muitos blogs de divulgação científica legais. Embora a internet não alcance a todos é uma boa ferramenta, considerando que atualmente somos mais de 20 milhões de brasileiros conectados. Mas este blog não é um blog de divulgação científica, pois não escrevo para um público leigo. Na verdade, sinceramente, eu não penso muito em quem vai lê-lo, pois eu sei que praticamente só 3.45 pessoas o lêem (e de vez em quando) hehehe. Além do que, a idéia inicial era fazer um blog para discutir protocolos, como "sugestão" do meu querido orientador Mauro. Mas é um bom exercício. E gostei desta coisa de blog! hehe mas diante disso tudo pensei em de repente tentar fazer um blog de divulgação científica de verdade, para “não cientistas”. Não seria muito, não alcançaria muita gente, mas já seria alguma coisa...além de um desafio para mim, escrever sobre ciência em uma linguagem compreensível para as pessoas em geral. A primeira parcela do meu débito com a sociedade. Vamos ver se eu dou conta! Enquanto isso, continuarei escrevendo “para as paredes” aqui sobre assuntos que interessam a mim e meia dúzia de pessoas no mundo todo...hehehe

Cell: novo volume dedicado somente a RNA!

Este blog vai virar oficialmente um culto ao RNA! Isso por que acaba de sair um volume especial da revista Cell (minha outra revista preferida!) todinho dedicado ao dito cujo. E ainda por cima com acesso free! Eu ja até tinha consultado uns dois artigos deste volume para os ultimos posts mas nao tinha me dado conta de que se tratava de um volume especial. E tem varias coisas interessantes, inclusive sobre small RNAs e sobre....Long noncoding RNAs! Estes, eu desconhecia a existencia! (por exceçao dos RNA ribossomais e transportadores). Enfim, muito pano para manga...muitas coisas que eu acho interessante e que provavelmente vou acabar escrevendo sobre aqui! Isso se eu puder voltar a usar meu computador... :-***(

Sem medo da biologia molecular

As técnicas de biologia molecular envolvendo manipulação de ácidos nucléicos começaram a surgir principalmente depois que a estrutura do DNA e o pareamento de bases foram elucidados em 1953 por Watson e Crick. Este simples artigo de duas páginas simplesmente abriu as portas para um mundo de novas possibilidades na biologia. Apenas 55 anos depois, a quantidade de abordagens moleculares disponível é enorme e só faz crescer. Genomas inteiros foram e estão sendo seqüenciados. É possível modificar geneticamente organismos, inclusive mamíferos. É possível quantificar a expressão de um, 100 ou 10 mil genes em um único experimento. É possível utilizar microrganismos para produzir em grande escala proteínas de outras espécies, como é feito com a insulina humana em bactérias Escherichia coli. Estes são apenas alguns exemplos destes avanços, mas já representam muita coisa: a quantidade de informação que se pode acessar com estas abordagens é imensa e um dos principais desafios tem sido justamente lidar com tanta informação.

Portanto, a biologia molecular só tem a acrescentar às técnicas já existentes. Com ela, é possível entender os processos biológicos mais intrinsecamente. É possível olhar para o nível mais básico, mas não menos importante de um organismo: o nível genético. As mais diversas áreas das ciências biológicas podem lançar mão da biologia molecular. No entanto, em algumas áreas acredito que ainda há alguma ou muita resistência. Por exemplo, a ecotoxicologia (a minha área) onde alguns são um pouco resistentes a idéia, temendo que a biologia molecular substitua as técnicas tradicionais para testes ecotoxicológicos. Na minha opinião, esta não é uma posição própria de um cientista: se uma técnica é melhor que a outra para responder uma mesma pergunta, que se substitua uma pela outra! Este é o objetivo. Mesmo excelentes cientistas deixaram de fazer grandes descobertas por estarem presos a conceitos e idéias. Não podemos ter medo do novo e nem nos acorrentar a uma idéia! Partimos de pressupostos, mas não podemos deixar que os mesmos ajam como âncoras e nos impeçam de ver uma possibilidade nova a nossa frente. Enfim, ao meu ver, um cientista tem que ter critérios mas tem também que ser open mind.


No entanto, particularmente na ecotoxicologia, por enquanto não acho que seja o caso de substituir uma coisa pela outra. As técnicas moleculares dão acesso a informações em um nível de organização biológica diferente das demais técnicas e vem a acrescentar no nosso entendimento dos mecanismos de toxicidade. E o mais importante é que podem nos permitir prever efeitos em níveis de organização biológica maiores, efeitos tardios e mais graves ecologicamente! A palavra importante aí é “prever”. Podemos prever os efeitos quando ainda há o que ser feito! E nisso a biologia molecular é pioneira. Pois as demais técnicas mostram os efeitos em níveis de organização maiores e, portanto, quando algum dano já foi feito. Pelo menos isso é o que eu penso, mas eu ainda sou peixe (ou seria melhor dizer ostra hehe) pequeno.

RNA: mais que um intermediário da informação genética!

No último post, eu falei um pouco sobre os microRNAs. No entanto, este é apenas um dos tipos de um grande número de small RNAs não codificantes (não são traduzidos em proteínas) que vem sendo descoberto nos últimos anos. Estas pequenas moléculas de RNA têm se mostrado importantes na regulação de uma série de eventos celulares relacionados ao desenvolvimento, defesa contra patógenos e resposta ao estresse através da regulação da expressão gênica praticamente em todas as suas etapas: transcrição, tradução, splicing, controlando a estrutura da cromatina e a estabilidade do RNA mensageiro. Isso aumenta consideralvemente o leque de funções atribuídas ao nosso já antigo conhecido ácido ribonucléico e tem mostrado aos cientistas que o RNA exerce um papel regulatório importante nos processos biológicos.

Para mim, no entanto, a nomeclatura e a classificação dos small RNAs era um pouco confusa e pesquisando achei algumas divergências. Até que encontrei um “background paper” muito bom da Nature que esclareceu quase todas as minhas dúvidas: claro, objetivo e breve! Não é a toa que a revista tem o índice de impacto que tem.

(abre parênteses) Estou cada vez mais convencida de que quanto maior um texto, pior. Para explicar claramente um conceito ou uma idéia, não é preciso se estender muito. Quando escrevemos muito, em geral, é por que não sabemos ou não entendemos bem sobre o que estamos falando. (fecha parênteses)

Pois bem, segundo o paper da Nature, os principais tipos de small RNAs são os seguintes:

1) micro RNAs (miRNAs) – com 20-22 nucleotídeos, regulam negativamente a expressão gênica, ligando-se aos mRNAs e impedindo a sua tradução. Acredita-se que esta ligação se dê por meio de um pareamento de bases imperfeito, gerando uma “bolha” no duplex miRNA:mRNA o que bloquearia a tradução pelo ribossomo.

2) Small interfering RNAs (siRNAs) – com aproximadamente 22 ntds, são os mediadores da “interferência de RNA” que tem sido amplamente utilizado para o silenciamento gênico experimental através da introdução de siRNAs sintéticos. Os siRNAs e miRNAs são produzidos a partir da mesma via a partir de precursores de RNA dupla fita, no entanto, se diferenciam pelo modo de ação. Enquanto, o miRNA impede a tradução do mRNA, o siRNA marca o mRNA alvo para degradação por endonucleases, pois ao se ligar aquele, o faz por meio de um pareamento de bases perfeito. Acredita-se que tenha surgido como um mecanismo de defesa contra moléculas de ácido nucléico invasoras em plantas (vírus, transposons...)

3) small nucleolar RNAs (snoRNAs) – clivam o préRNA ribossomal em suas subunidades funcionais 18S, 5.8S e 28S.

4) small nuclear RNAs (snRNAs) – são constituintes do spliceossoma (maquinaria envolvida no splicing processo através do qual são removidos os íntrons dos RNA mensangeiros). Alguns snRNAs apresentam atividade enzimática durante o splicing.

Bom, isso tudo para mim só faz crescer o argumento de que a complexidade dos organismos está intimamente relacionada com a capacidade de regular como os seus genes funcionam, como eu já discuti aqui antes. Além de que pode explicar por que os genomas são constituídos principalmente por sequências não codificantes: provavelmente, a maior parte do genoma está envolvida com sua própria regulação!


Para saber mais:

Buckingham S. The major world of microRNAs. Nature, 2003.

Carthew and Sontheimer. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell, 2009.

Kawaji H, Hayashizaki Y (2008) Exploration of Small RNAs. PLoS Genet 4(1)

National Science Foundation. "RNA Research Reveals New Responsibilities." ScienceDaily 6 September 2005. 13 March 2009

microRNAs, macroPossibilidades

Já algum tempo que tenho ouvido falar dos microRNAs, uma nova classe de RNAs curtos e não codificantes (não são traduzidos em proteínas), porém, não menos importantes! Estes pequenos segmentos de RNA (~20 bases) hibridam nos seus RNAs mensageiros alvo e assim regulam negativamente a sua tradução ou induzem a sua degradação. Em animais, os microRNAs hibridam com o mRNA alvo na sua UTR 3’ (untranslated region) por meio de um pareamento de bases imperfeito o que acaba por impedir o prosseguimento da tradução. Já em plantas, há complementariedade completa (ou quase) entre o microRNA e o seu alvo e portanto o pareamento entre os dois é perfeito, resultando na degradação por clivagem do mRNA alvo devido a formação de uma dupla fita de RNA que é imediatamente degradada.

O importante nesta história é que os microRNAs constituem mais um mecanismo de regulação da expressão gênica. Mais uma forma de se controlar com especificidade quando, onde e com que intensidade os genes são expressos. A importância evolutiva destes mecanismos refinados de controle da expressão gênica eu já discuti um pouco por aqui antes. A meu ver, no entanto, mais importante que saber quando um determinado gene é expresso, ou não, é identificar e entender que mecanismos o regulam. Entendendo-se esta mecânica e toda a sucessão de eventos moleculares envolvidas poderíamos, dadas as circunstâncias, prever como os genes se comportariam e com isso ter uma idéia das conseqüências, dos efeitos biológicos das mais diversas “circunstâncias”: doenças, estresse térmico, oxidativo, exposição a poluentes, drogas e fármacos, etc.

Colocado assim, talvez pareça simples, mas não é. Os genes são muitos e, para a maioria das espécies, os seqüenciados são poucos. E se não conhecemos os genes, como estudá-los? As circunstâncias são infinitas. Os mecanismos de regulação gênica também parecem ser muitos e complexos. Mas o que me chamou atenção nos microRNAs é que um mesmo microRNA pode regular a expressão de vários genes alvo, assim como fatores de transcrição regulam um grupo de genes, e assim influenciar diferentes vias simultaneamente. Cada via de regulação gênica tem como alvo um grupo de genes correlacionados que se comportam da mesma forma, dada uma certa circunstância. Os genes, por sua vez, podem estar sujeitos a regulação por diferentes vias e, portanto, podem fazer parte de diferentes grupos, dependendo das circunstâncias.

O que eu concluo disso tudo, que pode já ser óbvio para muitos, é que é importante e mais fácil primeiramente estudar os elementos chaves desta rede de vias de regulação gênica. E, acredito, que os microRNAs sejam um elemento chave importante e que até então era ignorado. Por exemplo, resolvi escrever este post quando estava lendo um paper que descrevia a identificação de novos microRNAs induzidos por metais pesados em arroz e também os possíveis alvos destes microRNAs (Huang et al, 2008). Então, acho que é mais parcimonioso avaliar o nível de expressão de um destes microRNAs (e por tabela dos seus genes alvo) do que olhar para cada um dos genes sujeitos a sua regulação...É claro, atualmente, existe a técnica de microarrays, que possibilita avaliar a expressão de milhares de genes e inclusive já vi trabalhos de microarray para microRNAs. No entanto, esta técnica ainda é muito cara e não está disponível para a maioria dos laboratórios. Então, para quem só possa fazer um PCR quantitativo ou semi quantitativo ou northen blot, avaliar a expressão de um só microRNA pode significar acessar a informações sobre os níveis de expressão gênica de muitos outros genes.

Além disso, a regulação por microRNAs parece ser bem comum (no genoma humano, já foram identificados 462 microRNAs e estima-se que este número chegue a 1000) e até pouco tempo não era nem considerada! É mais uma forma de regular a expressão dos genes e a nível pós transcricional, o que significa, por exemplo, que, ao menos em animais onde a tradução é apenas bloqueada pelos microRNAs, esta regulação não seria detectada por técnicas que avaliam os níveis de mRNA.

...talvez tenha sido um pouco confusa neste post! Isso que dá meses sem postar.

Tic-tac...tic-tac

Lendo um livro de Rubem Alves chamado “Filosofia da Ciência – Introdução ao jogo e suas regras” me deparei novamente com uma analogia que considero perfeita para entender o que é, como funciona, o que busca e o que produz a ciência.

Imagine-se vendo um relógio pela primeira vez e sendo impossível abri-lo como faria para compreender o seu mecanismo de funcionamento?

A ciência busca justamente resolver problemas como este, compreender mecanismos de funcionamento sem poder olhar diretamente para eles, sem ter acesso direto à realidade. A ciência busca o invisível.

E o primeiro passo é olhar para os fatos. Neste caso, por exemplo, um mostrador, com ponteiros que giram regularmente, a velocidades diferentes, mas constantes. Mas os fatos são apenas dados, não fornecem explicação alguma sobre o mecanismo do relógio e, na verdade, constituem o problema a ser resolvido pelo cientista.

Neste ponto, a imaginação é essencial, como disse Eisntein, “a imaginação é mais importante que o conhecimento”. É necessário que o cientista dê um “pulo mental” e construa mentalmente o que ele não pode ver: um mecanismo que explique os fatos, que são os dados a que se tem acesso direto. A estes mecanismos assim construídos chamamos de modelos. As pessoas tendem a achar que modelos e teorias científicas são verdadeiras, mas modelos não são cópias da realidade, pois não temos acesso a ela, não podemos abrir o relógio para saber se o modelo corresponde ao real mecanismo e, portanto, não podemos dizer que são verdadeiros. Mas, então que validade tem os modelos e teorias científicas? Aceitamos os modelos e as teorias que funcionam. Que se mostram universalmente válidos, cujas previsões se mostram corretas. E para isso, pagamos para ver, pesquisamos, testamos, experimentamos.

Uma questão interessante que Rubem Alves discute é que, quando observamos os fatos nos quais baseamos nossos modelos, não temos garantia alguma de que no futuro, a natureza irá se comportar da mesma forma que no passado,  “Em todos os raciocínios derivados da experiência existe um passo dado pela mente que não é apoiado por nenhum argumento ou processo do entendimento” (David Hume) e este passo é “a passagem do passado para o futuro, do particular para o geral que se dá por meio da estreita e ignorada ponte da fé e da aposta”...mas, como eu disse antes, em ciência, não fazemos apenas apostas e damos palpites (modelos), mas pagamos para ver...experimentando, testando a funcionalidade, universalidade e a capacidade de previsão dos modelos e teorias em que apostamos nossas moedas. A ciência produz modelos hipotéticos e provisórios da realidade que serão aceitos enquanto funcionarem de forma adequada e que serão colocados em questão e eventualmente substituídos assim que deixarem de cumprir suas promessas...

Obs.: a primeira vez que vi esta analogia do relógio foi durante o meu estágio no CAp da UFRJ. Na verdade, não era um relógio, mas uma caixa construída pelos professores que tinha algumas alavancas (na verdade, eu não sei como funciona, pois não usei com os alunos das minhas turmas). Mas a idéia era que os alunos desenvolvessem um modelo para explicar como funcionava a caixa, sem, obviamente, olhar seu interior e com isso discutir os conceitos de ciência e de modelos científicos. Queria eu ter tido uma aula assim, ainda no início do ensino fundamental! A maioria das escolas não se dá ao trabalho de discutir estas questões nas aulas de ciências...mas apenas coloca o conhecimento científico como algo definitivo e estático.