6 de agosto de 2008

Primer design

Desenhar um par de primers é bem simples, certo? É só desenhar oligonucleotídeos homólogos às regiões que flanqueiam a sua seqüência alvo. Na verdade, não é tão simples assim, ao menos se você realmente quer que seu PCR funcione. E que funcione bem: com uma eficiência alta e sem bandas não específicas. Além disso, depende muito de o que você quer amplificar (DNA genômico, um gene clonado em um vetor, cDNA?). A primeira vez em que eu desenhei um par de primers na minha vida, foi bem simples, eu fiz literalmente à mão. Peguei a seqüência ao alvo (um gene já seqüenciado e isolado em um vetor plasmidial) e desenhei um oligo para anelar no início e outro para anelar no fim do gene e adicionei um sítio de restrição a cauda 5’ de cada um dos primers, para posterior clonagem do amplicom em um vetor diferente. Depois chequei num programa de computador (oligocalculator) o conteúdo de GC e o Tm, para saber se eram compatíveis. E os primers funcionaram muito bem, obrigado! Mas hoje, eu acho que dei um pouco de sorte, pois eu não chequei várias coisas nestes primers que poderiam ter condenado o PCR a um desastre!




Agora, estou eu novamente desenhando primers, mas desta vez, usando um programa para isso, o primer3. Mas o contexto é bem diferente: tenho apenas o começo da seqüência alvo, logo, para os primers reverse e internos (nested), preciso lançar mão de um alinhamento de seqüências conhecidas para o mesmo gene de interesse em outras espécies, sendo que queremos amplificar o cDNA, mas nos bancos de dados há apenas seqüências genômicas disponíveis (sem os íntrons anotados, é claro, para facilitar).


Bom, mas quando eu já tinha feito quase todos os primers que eu queria com o primer3, comecei a ficar preocupada se este programa realmente fornecia oligos que não formem estruturas secundárias (grampos) e que não formassem dímeros. Procurei na Internet um programa que verificasse isso, especificamente, só para garantir, e achei o Netprimer, que verifica o potencial do primer em forma grampos (hairpin), dímeros, dímeros cruzados, seqüências palindrômicas, repetições e “runs” de um nucleotídeo (pelo menos 3 nucleotídeos iguais repetidos). Todas estas coisas podem diminuir em muito a eficiência do PCR: um primer que forma um grampo, não vai hibridizar na seqüência alvo (ou com uma eficiência muito baixa), se os primers formam dímeros, competem com a seqüência alvo, ou seja, a quantidade de primer realmente disponível para hibridizar na seqüência alvo, diminui drasticamente, etc. E qual foi a minha surpresa quando submeti as seqüências dos meus primers neste programa? De 4 primers, apenas 1 sobreviveu! Sendo que para cada um destes primers, o primer3 ainda me deu outros 4 oligos alternativos, mas todos eles também tinham algum problema! Ou seja, 15 primers diferentes e TODOS eles tinham algum (ás vezes, mais de um) destes problemas, como nas figuras abaixo, onde a primeira mostra a formação de um grampo e a segunda, de um dímero.




Além destas estruturas, ao se desenhar os primers, deve-se ter outras preocupações:

- Evitar “runs” de 3 ou mais G ou C na terminação 3’, pois pode diminuir a especificidade, uma vez que isso aumenta a estabilidade de hibridizações não específicas e a região 3’ é crítica para a especificidade e sensibilidade do PCR.
- Evitar um nucleotídeo T na terminação 3’.
- Evitar complementaridade entre os primers (para evitar a formação de dímeros).

Há muito mais sobre primers, mas como eu ainda não resolvi os problemas dos meus próprios, não vai dar para me estender além disso por aqui agora...



4 comentários:

Eliane, a Lia disse...

parece fácil mais não é! vixi!
parece a brincadeira do "chefinho mandô": faz isso, faz aquilo, faz mais isso e no final vc não consegue fazer mais nada! huahuahauhauha
boa sorte, pena que não tenho grandes conhecimentos para ajudar, mas tô aprendendo pra kct!

Juliana Americo disse...

Foi exatamente assim que eu estava me sentindo...se cumprisse todas as "exigências", no final das contas não chegaria a primer algum...felizmente, consegui chegar a algum lugar! hehe vamos ver se vai funcionar...
bjs

teclado espiao disse...
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Juliano Sales Mendes disse...

Olá, você sabe como baixar o software Gene Runner em Win7 64 bits?
Obrigado!