PCR: uma boa idéia!

A PCR (reação em cadeia da polimerase) sem dúvida foi uma invenção que revolucionou a biologia molecular ao permitir a síntese de DNA in vitro. Através desta técnica, é possível produzir bilhões de cópias de um segmento de DNA específico, a partir de uma única molécula! Pelo menos, em um mundo perfeito. Mais de duas décadas depois da sua invenção, já são muitas as variações e aplicações da PCR como no diagnóstico de doenças, na contagem de carga viral, na detecção de patógenos, em exames forenses e  como ferramenta em uma quase infinita lista de abordagens de pesquisa.

Kary B. Mullis foi o cara que inventou o PCR e por isso ganhou o prêmio nobel de química de 1993. Na época, ele trabalhava em uma empresa a quem vendeu sua idéia pela quantia irrisória de 10 mil dólares. A empresa vendeu a patente por 300 bilhões de dólares! Ou seja, Kary se deu mal, mas ganhou seu 1 milhão de dólares do prêmio Nobel e, hoje, ainda ganha muito dinheiro vendendo livros e dando palestras por aí.

Na verdade, há quem diga que Mullis somente incrementou o processo já descrito por H. Gobind Khorana e Kjell Kleppe, 17 anos antes, quando  conseguiram duplicar e, em seguida, quadruplicar uma pequena molécula de DNA sintético usando um par de primers e uma DNA polimerase. De qualquer forma, foi um "incremento" que fez toda diferença: usar a ciclagem de temperaturas e uma DNA polimerase resistente ao calor, uma vez que a cada ciclo é preciso aquecer o DNA a 94ºC para separar a dupla fita, o que tornava necessário adicionar mais DNA polimerase a cada ciclo.

Eis uma citação de Millis sobre como ele teve a idéia da PCR:

“Sometimes a good idea comes to you when you are not looking for it. Through an improbable combination of coincidences, naiveté and lucky mistakes, such a revelation came to me one Friday night in April, 1983, as I gripped the steering wheel of my car and snaked along a moonlit mountain road into northern California’s redwood country. That was how I stumbled across a process that could make unlimited numbers of copies of genes, a process now known as the polymerase chain reaction (PCR).”

Kary B. Mullis, Scientific American (1990) 262:36.

Eu não acredito em sorte, mas em mentes preparadas para enxergar uma nova idéia...alguns podem chamar de inspiração, mas acho que é um conjunto de fatores, não apenas conhecimento e inteligência, mas maturidade, desprendimento e persistência. É ter em mãos um punhado de coisas aparentemente inúteis e enxergar algo grande que se pode fazer com elas. E depois todos dizem, “como eu não tive esta idéia antes?”. As melhores idéias, quando expostas parecem muito simples, tão simples que ninguém nunca pensou antes! Para mim, a sofisticação está na simplicidade. Em diversos contextos. E por mais estranho que pareça, nem sempre é fácil encontrar a solução mais simples. Mas pode parecer mais inspirador ouvir que estas idéias surgem assim, como uma lâmpada que acende de repente por pura "sorte", como a "revelação" descrita por Mullis.

Anyway, obrigada Mullis! O que seria de nós sem o PCR....

O fim (?) da novela "primer design"

Só para fechar esta questão dos primers: um guideline no site da Premier Biosoft (a empresa do netprimer e do primerpremier) me ajudou bastante fornecendo os valores toleráveis de deltaG para cada uma das possíveis estruturas secundárias para os primers em questão. O deltaG (variação de energia livre) indica a quantidade de energia necessária para romper com a estutura secundária e é utilizado como uma medida da estabilidade destas estruturas. Quanto mais negativo for o deltaG, mais estável é a estrutura e, portanto, piores são os efeitos no PCR! Mas, não é preciso ficar desesperado como eu fiquei quando o programa acusar estruturas em todos os seus primers. Se o deltaG for baixo, provavelmente, aquela estrutura não vai se manter na temperatura de anelamento dos primers durante o PCR e não vai interferir na eficiência da reação de amplificação. Por enquanto, meus primers estão ok, embora nem todos estejam funcionando (mas acredito que por outros motivos).

Para saber mais e conhecer os valores de deltaG toleráveis em cada caso: http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html

No próximo post, vou falar sobre outro tipo de "design" :)

Primer design

Desenhar um par de primers é bem simples, certo? É só desenhar oligonucleotídeos homólogos às regiões que flanqueiam a sua seqüência alvo. Na verdade, não é tão simples assim, ao menos se você realmente quer que seu PCR funcione. E que funcione bem: com uma eficiência alta e sem bandas não específicas. Além disso, depende muito de o que você quer amplificar (DNA genômico, um gene clonado em um vetor, cDNA?). A primeira vez em que eu desenhei um par de primers na minha vida, foi bem simples, eu fiz literalmente à mão. Peguei a seqüência ao alvo (um gene já seqüenciado e isolado em um vetor plasmidial) e desenhei um oligo para anelar no início e outro para anelar no fim do gene e adicionei um sítio de restrição a cauda 5’ de cada um dos primers, para posterior clonagem do amplicom em um vetor diferente. Depois chequei num programa de computador (oligocalculator) o conteúdo de GC e o Tm, para saber se eram compatíveis. E os primers funcionaram muito bem, obrigado! Mas hoje, eu acho que dei um pouco de sorte, pois eu não chequei várias coisas nestes primers que poderiam ter condenado o PCR a um desastre!

Agora, estou eu novamente desenhando primers, mas desta vez, usando um programa para isso, o primer3. Mas o contexto é bem diferente: tenho apenas o começo da seqüência alvo, logo, para os primers reverse e internos (nested), preciso lançar mão de um alinhamento de seqüências conhecidas para o mesmo gene de interesse em outras espécies, sendo que queremos amplificar o cDNA, mas nos bancos de dados há apenas seqüências genômicas disponíveis (sem os íntrons anotados, é claro, para facilitar).

Bom, mas quando eu já tinha feito quase todos os primers que eu queria com o primer3, comecei a ficar preocupada se este programa realmente fornecia oligos que não formem estruturas secundárias (grampos) e que não formassem dímeros. Procurei na Internet um programa que verificasse isso, especificamente, só para garantir, e achei o Netprimer, que verifica o potencial do primer em forma grampos (hairpin), dímeros, dímeros cruzados, seqüências palindrômicas, repetições e “runs” de um nucleotídeo (pelo menos 3 nucleotídeos iguais repetidos). Todas estas coisas podem diminuir em muito a eficiência do PCR: um primer que forma um grampo, não vai hibridizar na seqüência alvo (ou com uma eficiência muito baixa), se os primers formam dímeros, competem com a seqüência alvo, ou seja, a quantidade de primer realmente disponível para hibridizar na seqüência alvo, diminui drasticamente, etc. E qual foi a minha surpresa quando submeti as seqüências dos meus primers neste programa? De 4 primers, apenas 1 sobreviveu! Sendo que para cada um destes primers, o primer3 ainda me deu outros 4 oligos alternativos, mas todos eles também tinham algum problema! Ou seja, 15 primers diferentes e TODOS eles tinham algum (ás vezes, mais de um) destes problemas, como nas figuras abaixo, onde a primeira mostra a formação de um grampo e a segunda, de um dímero.

Além destas estruturas, ao se desenhar os primers, deve-se ter outras preocupações:
- Evitar “runs” de 3 ou mais G ou C na terminação 3’, pois pode diminuir a especificidade, uma vez que isso aumenta a estabilidade de hibridizações não específicas e a região 3’ é crítica para a especificidade e sensibilidade do PCR.
- Evitar um nucleotídeo T na terminação 3’.
- Evitar complementaridade entre os primers (para evitar a formação de dímeros).

Há muito mais sobre primers, mas como eu ainda não resolvi os problemas dos meus próprios, não vai dar para me estender além disso por aqui agora...