"Música para minhas ostras"

Em um dos meus últimos textos, escrevi sobre os desafios que as ostras enfrentam por não poderem se locomover: quando algo no ambiente ao seu redor não vai bem, elas tem que lidar com isso, pois fugir não é uma opção. Mas algo que não mencionei é que as ostras não são sésseis durante toda a sua vida. Nos primeiros estágios do seu desenvolvimento, elas passam por fases larvais quando, apesar de não nadarem ativamente contra correntes, se movem verticalmente, para cima e para baixo, na coluna d'água. Nesta fase da vida, a larva tem que "tomar uma decisão" que irá determinar a sua sobrevivência: selecionar um local apropriado para se estabelecer, se fixar e continuar o seu desenvolvimento até a fase adulta e séssil. Um local para passar o resto da sua vida. Uma grande decisão! Como estas pequenas larvas, comparáveis a uma gota no oceano, conseguem fazer isso é uma pergunta que cientistas já vinham investigando, mas que ainda não sabem responder completamente.

Sabemos que as larvas conseguem processar alguns sinais físicos e químicos do ambiente, como salinidade, a presença de substâncias químicas e características como a textura da superfície. Mas estes são fatores que só podem ser avaliados em pequena escala, em uma pequena área, pré selecionada pela larva. É como procurar um apartamento para morar. Primeiro, você irá escolher um ou poucos bairros de preferência, em seguida, irá selecionar anúncios que parecem atender as suas necessidades de preço, espaço, etc, e, por fim, irá selecionar somente alguns apartamentos para visitar pessoalmente, pois seria impossível visitar todos os apartamentos a venda em uma grande cidade. Da mesma forma, seria impossível para uma larva inspecionar todo o fundo do mar, até encontrar um local apropriado para se fixar. Já que larvas não podem ligar para um corretor, como elas fazem isso?

Acontece que as ostras gostam de uma vizinhança barulhenta. Os recifes e outras zonas entremarés, locais preferidos pelas ostras, são ecossistemas que produzem bastante ruído. Ao contrário de outras áreas do fundo do mar, que não tem uma concentração grande de organismos, os recifes estão repletos de peixes e invertebrados que produzem ruídos tão altos que podem até ser ouvidos por mergulhadores. 

Pesquisadores da Universidade da Carolina do Norte (EUA) se perguntaram se as larvas de alguma forma se guiam pelos sons emitidos por esses ecossistemas. Para testar esta hipótese, eles gravaram os sons de um recife de ostras e também de uma área sem recifes e viram que os perfis sonoros produzidos são realmente diferentes. No laboratório, eles fizeram testes com larvas em tanques, e viram que um maior número de larvas se fixou no substrato quando expostas aos sons característicos de um recife, do que quando expostas aos sons da zona sem recifes ou a som algum. Os pesquisadores também fizeram esse experimento no ambiente natural, colocando as larvas, em recipientes que somente o som atravessa, nas águas de um recife, e em uma área sem recifes. O mesmo resultado foi obtido! 

Tudo isso indica que o som é realmente um sinal importante para as larvas se estabelecerem no ambiente apropriado e, é possível que isso também se aplique a várias outras espécies animais que também passam pelo estágio de larva. Mais do que interessante, esta descoberta é importante para a conservação destas espécies, para projetos que buscam recuperar recifes de ostras, ameaçados em muitas partes do mundo, e levanta questões importantes sobre os impactos da poluição sonora em ambientes aquáticos. E como na ciência, uma resposta acaba criando novas perguntas, fica a questão: como as larvas percebem, processam e interpretam o som? 

-------------------------------------------------

Ficou curioso para saber como é o som dos recifes de ostras? Você pode ouvir as gravações feitas pelos cientistas neste site: http://www.dosits.org/audio/interactive/#/78

--------------------------------------------------

Referências:

Lillis, Ashlee et al. (2013) Oyster Larvae Settle in Response to Habitat-Associated Underwater Sounds. Plos One, 8(10), e79337. DOI: 10.1371/journal.pone.0079337 

Listen Up: Oysters May Use Sound to Select a Home: http://news.ncsu.edu/releases/oyster-sound/

Feliz Dia do DNA!

Em 1953, há exatos 60 anos, Watson e Crick desvendaram a estrutura do DNA e o pareamento de bases e assim abriram caminho para um mundo de possibilidades na biologia. Hoje, muitas destas possibilidades se tornaram realidade e até exceção para a famosa dupla hélice de DNA foi encontrada, com a descoberta do DNA quadrúplex-G em células humanas. Por outro lado, somente no ano passado foi possível fotografar diretamente a dupla hélice do DNA, que até então havia sido evidenciada apenas por métodos indiretos (mas não pouco precisos!).

À esquerda, representação do DNA quadrúplex-G (crédito: Thomas Splettstoesser). Á direita, primeira foto do DNA dupla hélice obtida por microscopia eletrônica (crédito:  Enzo Di Fabrizio) 

 

É praticamente impossível resumir tudo o que foi feito na área da genética molecular neste período, mas alguns números nos mostram a dimensão da produção científica nestes 60 anos. No Pubmed, um dos principais bancos de dados para pesquisas bibliográficas na área biomédica, há mais de 1,7 milhão de artigos publicados contendo o termo “gene”. O GenBank, banco de dados de sequências de DNA, não para de crescer e atualmente possui cerca de 1,6 bilhão de sequencias de DNA depositadas por pesquisadores de todo o mundo. Depois do sequenciamento do primeiro genoma humano, que inaugurou esta era de genomas completos, os genomas de outras 1000 pessoas já foram sequenciados. Antes, havíamos conhecimento das causas genéticas de apenas 60 doenças humanas, hoje, este número aumentou para 5000! E, além disso, o genoma de outras 182 espécies eucarióticas e de 4143 procariotos já foram sequenciados (Fonte: GOLD genomes online database).

Todo esse conhecimento nos ajuda a entender mais sobre a biologia de cada espécie, como também sobre como elas se relacionam e como evoluem. Quanto mais genomas conhecemos, melhor conseguimos identificar quais são as “peças” fundamentais em qualquer sistema biológico e quais são as “peças” exclusivas que tornam cada espécie única, não só na sua forma, como nas suas estratégias para sobreviverem em um ambiente particular. Os aplicações e desdobramentos deste conhecimento são muitos e fazem crescer a passos largos as áreas de biotecnologia e biologia sintética que buscam criar soluções com base em sistemas biológicos.

No dia do DNA, temos muito o que comemorar! Mas temos também muito o que desejar, pois ainda há muito para descobrirmos, entendermos e, por que não, criarmos nesta área. 

Feliz dia do DNA!

Com quantos genes se faz uma ostra?

Diante de uma ameaça ou perigo eminente, qual a sua reação? Eu admito que quando aparece uma barata, eu saio correndo! Embora baratas não façam mal algum, diante de uma ameaça real, nosso instinto geralmente é o de fuga. É fácil entender porque poder se locomover é uma grande vantagem entre os animais e não somente em situações de perigo eminente, como a aproximação de um predador. Se por qualquer motivo “o mar não estiver para peixe”, é possível procurar refúgio ou melhores condições de vida em outro lugar, com maior disponibilidade de alimento ou um clima mais ameno, por exemplo. Além disso, poder dar uma voltinha por aí também pode aumentar as chances de encontrar um parceiro! ;-)

Ainda assim, muitos animais são sésseis, não podem se locomover. As ostras são assim. E você pode imaginar que esse modo de vida não é nada fácil. E para piorar, as ostras escolheram um ambiente bastante estressante para viver: os estuários.

Um estuário é um ambiente de transição entre um rio e o mar e está sempre mudando, pois está sobre a influência das marés. Quando a maré sobe, há uma maior quantidade de água salgada e menor de água doce, proveniente do rio e quando baixa, esse quadro se inverte. Assim, a quantidade de sal na água varia com a maré, mas nunca chega a ser totalmente doce ou salgada, é algo intermediário: salobra.

Também em função da maré, as margens ora estão expostas ao ar, ora, alagadas. Com isso, as ostras são periodicamente expostas ao ar (e muitas vezes a um sol escaldante!) por várias horas. E isso não é tudo. A água de um estuário é cheia de patógenos, vírus, bactérias, fungos e protozoários que podem causar doenças nas ostras. E atualmente muitos estuários recebem uma “carga extra” de patógenos e de substâncias tóxicas resultantes da poluição causada pelo homem. No final das contas, é impressionante como as ostras, sem nunca sairem do lugar, conseguem lidar com tantas perturbações e sobreviverem nesse ambiente.

A adaptação à vida séssil (e estressante!) mais óbvia das ostras é a espessa e resistente concha. Poucos predadores conseguem quebrá-la (um deles é a estrela do mar) e quando a maré baixa e a ostra é exposta ao ar, ou quando a água não está lá essas coisas, a ostra apenas fecha hermeticamente a sua concha e consegue ficar assim por até vários dias. Mas por mais espessa que a concha seja, ela não resolve todos os problemas e ficar trancafiada por dias com apenas uma pequena quantidade de água sob sol forte também não parece sustentável a longo prazo.

A ostra do Pacífico (Crassostrea gigas) foi o primeiro molusco a ter o genoma sequenciado (Zhang et al., 2012). E o que os pesquisadores encontraram no seu genoma reflete a sua incrível adaptação a este ambiente e explica muito da sua grande resistência ao estresse ambiental. Eles viram que entre os mais de 28 mil genes desta ostra existem muito mais genes de defesa do que em outros animais, entre os quais, genes de proteínas do sistema imune, de antioxidantes, de enzimas que metabolizam compostos tóxicos e de proteínas que inibem a morte celular.

Por exemplo, a C. gigas possui 88 proteínas do tipo HSP70, uma quantidade nunca vista em nenhum outro animal. As HSP70 são importantes para manter a estrutura das outras proteínas celulares intactas, principalmente em situações de estresse como o calor excessivo, garantindo que elas continuem a funcionar corretamente. Para você ter uma ideia, nós humanos temos apenas 17 proteínas HSP70 em nosso genoma. Deu para ver como as ostras estão muito mais bem equipadas, não é?

O genoma de C. gigas também possui um grande número de genes envolvidos na sinalização celular. É através de sofisticados mecanismos de sinalização, que grande parte dos processos que ocorrem em uma célula são regulados e podem responder a estímulos vindos do ambiente. O grande número de genes envolvidos nesses mecanismos sugere que a sinalização celular em C. gigas é bastante complexa e deve exercer um papel importante “orquestrando” os seus mecanismos de defesa que também não perdem em complexidade: mais de 5 mil genes da ostra respondem ao estresse, aumentando ou diminuindo a sua atividade.

No final das contas, um organismo aparentemente simples e, digamos a verdade, que mais parece uma pedra, esconde uma grande complexidade biológica. Da próxima vez que você apreciar uma ostra com limão, lembre-se que você estará comendo um verdadeiro arsenal genético contra o estresse ambiental! 

Agora, imaginem o que não encontraremos no genoma do mexilhão dourado, uma espécie invasora, extremamente resistente, de crescimento e reprodução rápidos e de difícil controle? Se você também se preocupa com os danos ecológicos que o mexilhão dourado pode causar no nosso país e acredita que conhecer seu genoma é um passo estratégico e importante para o seu combate, pode nos ajudar a financiar o projeto de sequenciamento do seu genoma. Você pode dar qualquer "forcinha" a partir de R$10 e, como agradecimento, um gene do mexilhão dourado será nomeado em sua homenagem!  :-) Assista o vídeo abaixo (de apenas 4 minutos!) e acesse o site (http://catarse.me/pt/genoma) para conhecer melhor o projeto.

Referência:

Guofan Zhang, Xiaodong Fang, Ximing Guo, Li Li, Ruibang Luo, Fei Xu, Pengcheng Yang, Linlin Zhang, Xiaotong Wang, Haigang Qi, Zhiqiang Xiong, Huayong Que, Yinlong Xie, Peter W. H. Holland, Jordi Paps, Yabing Zhu, Fucun Wu, Yuanxin Chen, Jiafeng Wang, Chunfang Peng, Jie Meng, Lan Yang, Jun Liu, Bo Wen, Na Zhang et al. The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation. Nature 490, 49–54 (04 October 2012)

Entre na luta contra o mexilhão dourado, uma ameaça a biodiversidade brasileira!

Já ouviu falar do mexilhão dourado? É um pequeno molusco invasor que está se espalhando pelo Brasil. Ele se reproduz e cresce muito rapidamente e se encrusta em tudo, chegando a obstruir grandes tubulações! Mas além disso, ele interfere nas relações de alimentação das outras espécies e pode eliminar espécies nativas. O mexilhão dourado já está no Pantanal e ameaça invadir a bacia Amazônica, colocando em risco a nossa biodiversidade! 

O vídeo abaixo explica bem, de forma divertida e em apenas quatro minutos este sério problema! E o mais legal é que você pode nos ajudar a combater esta praga! Com a sua ajuda, iremos sequenciar o genoma do mexilhão dourado e poderemos entender melhor a sua biologia e o que faz dele um invasor tão bem sucedido! É conhecendo bem este "inimigo" que poderemos identificar suas fraquezas e desenvolver estratégias para eliminá-lo! Esta é a primeira iniciativa de financiamento colaborativo de um projeto científico no Brasil, um modelo de financiamento que já tem ajudado a tornar projetos científicos em realidade em vários outros países. 

Faça parte desta luta contra o mexilhão dourado você também! Colabore (com qualquer quantia acima de R$10) e compartilhe o projeto com seus amigos! A biodiversidade brasileira agradece! :-)

E se você quiser conhecer um pouco mais do nosso laboratório, pode dar uma olhada nesta apresentação:

SHORT TIPS: Eletroforese em gel de agarose

Quem trabalha com biologia molecular faz pelo menos alguns géis de agarose por semana. Ainda que seja uma técnica simples e de rotina, existem alguns "pulos do gato" para você conseguir resolver os fragmentos de DNA corretamente e ainda obter aquela "foto de livro didático"! Eu já dei algumas dicas por aqui antes, mas vamos ver mais algumas.

Concentração de agarose. A primeira coisa importante é usar a concentração de agarose adequada para separar os fragmentos de DNA analisados. Neste link, você pode descobrir a concentração recomendada para cada faixa de tamanho de DNA. Em alguns casos, quando os fragmentos forem muito pequenos, pode ajudar usar uma agarose de alta resolução.

Quantidade de DNA aplicado. Ninguém quer se dar ao trabalho de correr um gel e depois se deparar com uma banda muito fraca. Mas aplicar DNA demais pode resultar na famosa banda "smeared" (borrada). Em geral, de 100 a 200 ng para um poço de 1 mm é suficiente. O volume de amostra também é importante, deve preencher pelo menos 1/3 do poço e deve ser igual ao volume de padrão aplicado. Isso irá evitar a formação de bandas curvadas e differenças entre a migração do padrão e das suas amostras.

Se a sua amostra contém alguma enzima que se liga ao DNA, como ligases e enzimas de restrição, estas proteínas podem alterar o padrão de migração do DNA e gerar aquelas bandas tortas que a gente tanto detesta. A solução é adicionar SDS (concentração final 0.01%) para romper as interações destas proteínas com o DNA. Após adicionar o SDS, aqueça as amostras a 65ºC por 10 minutos, coloque-as em em gelo e depois aplique no gel.

Por fim, se você costuma usar brometo de etídeo, na minha opnião a forma de usá-lo que fornece os melhores resultados é adicioná-lo no gel ou com a amostra. Existem corantes menos tóxicos (e mais sensíveis), mas alguns podem alterar o padrão de migração do DNA, então é sempre bom testar antes de decidir mudar para um novo corante.

SHORT TIPS: Digestão virtual de DNA

Muitos métodos de clonagem que dispensam o uso de enzimas de restrição já surgiram, mas estas enzimas ainda estão longe de sair de moda. Mesmo porque elas não servem apenas para isso.

Existem várias ferramentas online para verificar quais sítios de restrição estão presentes em uma dada sequência de DNA.

O Webcutter  tem uma interface bem simples e poucos recursos, mas faz bem o básico e tem o diferencial de ter a opção de buscar na sequência analisada por regiões que possam originar um determinado sítio de restrição através de mutagenese. (Apesar de ser o mais simples, é o único com um logo legal!)

Já o  RestrictionMapper além de criar o mapa de restrição da sua sequência, ou seja, apontar todos os sítios de restrição que ocorrem nela, também permite fazer uma digestão virtual do DNA. Você coloca a sua sequencia de DNA, escolhe que enzimas quer "usar" e o programa te mostra quais os fragmentos serão gerados a partir desta digestão simulada.

Mas o meu preferido é o NEBcutter. Ele gera uma representação gráfica do mapa de restrição da sua sequência e ainda permite que você dê zoom em uma região particular e, por fim, você pode baixar um relatório com todos as enzimas que cortam sua sequencia, ou somente aqueles que cortam 1, 2 ou 3 vezes ou mesmo nenhuma, afinal esta informação muitas vezes também é bem importante! Mas o mais legal de tudo é que, assim como RestrictionMapper, o NEBcutter também faz digestão virtual ("custom digestion"), mas ele ainda gera uma imagem de como deverá ser o gel de agarose do resultado esperado da sua digestão! Você pode escolher a concentração de agarose e o padrão de tamanho de fragmento a ser utilizado. Bem legal, não? Mas mais do que isso, uma mão na roda!

Troubleshooting: Seu RNA é uma goma...e agora?

 Leitor do RNAse Free (por e-mail):

Quando vou fazer a extração de RNA de músculo de anfíbios há a formação de uma "goma" que não se desfaz e isso acaba prejudicando o resultado final. Já tentei a extração por kit e tradicional, mas nada funciona. Você já teve uma experiência como essa?

Sim, eu já tive uma experiência como esta! Ao extrair RNA de músculo de ostra por extração orgânica/ácida (com o famoso reagente "rosinha" que não cito o nome para não fazer propaganda de graça! rs), eu tive exatamente este problema. O pellet obtido era um material gelatinoso e insolúvel, que não dissolvia em água por nada.

A resposta para este problema eu encontrei no manual do reagente de extração de RNA. A presença de material insolúvel pode acontecer com tecidos com alto teor de proteínas, gorduras, polissacarídeos ou material extracelular. O músculo é um exemplo destes tecidos "problemáticos", pois tem alto teor de polissacarídeos e proteínas, como o colágeno, que acabam formando o material insolúvel obtido no final da extração.

A solução indicada no manual é bem simples e funcionou com as minhas amostras de músculo de ostra. Após homogeneizar o tecido no reagente de extração, deve-se centrifugar o homogenato obtido (12000xg, 4ºC, durante 10 minutos). Após esta centrifugação, o material insolúvel em questão estará precipitado. Deve-se, então, transferir o sobrenadante para um novo tubo e descartar este precipitado. A partir daí, basta dar continuidade ao protocolo recomendado.

Na época, isso foi o suficiente para resolver o problema. Mas além desta centrifugação extra, uma purificação com cloreto de lítio pode ajudar também! Eu sou "fã" do cloreto de lítio, como já falei aqui, por que ele precipita RNA, mas não precipita DNA, proteínas e polissacarídeos. E, portanto, remove estes contaminantes da amostra de RNA. Quem quiser saber mais sobre o cloreto de lítio, pode dar uma olhada neste link: "The Use of LiCl Precipitation for RNA Purification".

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Envie suas perguntas na forma de comentários ou por e-mail (blog.rnase.free @ gmail. com) e suas dúvidas poderão dar origem a um post na sessão "Troubleshooting" do RNAse Free.

10th International Congress on Cell Biology

Hoje, estive no 10th International Congress on Cell Biology, este ano realizado aqui no Rio de Janeiro. Como parte do mini-curso "Cellular and Molecular Tools in Invertebrate Models", falei um pouco sobre PCR quantitativo com algumas considerações para quem trabalha com invertebrados. Quem quiser dar uma olhada, os slides do mini-curso estão disponíveis aqui, logo abaixo.

O marisco de 400 anos – como um pequeno molusco engana o tempo e vive através dos séculos.

“Posso ouvir o vento passar,
assistir à onda bater,
mas o estrago que faz
a vida é curta pra ver...”

(O vento, Marcelo Camelo)

Para alguns animais, a vida é ainda mais curta do que para outros. Quase tão curta quanto o breve intervalo de tempo entre marés. As efémeras são pequenos insetos que, como o nome sugere, vivem por pouco tempo, cerca de um dia. A efémera adulta vive algumas horas, não se alimenta e investe sua energia na reprodução, para deixar filhotes que também viverão somente o dia seguinte. Mas alguns animais tem uma estratégia de vida diferente e investem a maior parte da sua energia no crescimento e manutenção corporal. Pensando neste extremo oposto, tente adivinhar que animal vive por mais tempo e você provavelmente pensará nos elefantes, que vivem em média 70 anos, ou talvez nas tartarugas, que podem atingir 150 anos. Mas se engana quem pensa que eles batem o recorde. O recordista é um pequeno marisco, parente das ostras e mexilhões, chamado Arctica islandica. Ele vive enterrado no fundo do frio oceano Atlântico norte e pode viver mais de 400 incríveis anos.

Continue a ler no blog do Bioma

SHORT TIPS - Quando as bandas do gel sorriem...

...não é um bom sinal! 


Depois de correr uma reação de PCR em um gel agarose, você já se deparou com uma banda tão torta que chega a parecer um sorriso? 

Apesar do DNA ser o código da vida, não, ele não está criando vida própria. Alguns pequenos erros explicam isso:

1. O gel não ficou complemente submerso no tampão de corrida.
2. O volume de amostra aplicado no gel foi muito pequeno (deve ocupar pelo menos 1/3 do volume do poço).
3. Condições de corrida impróprias. A pressa pode nos tentar a aumentar a voltagem. Mas existe um limite de voltagem que depende do tamanho do gel e da cuba. Não use mais que 5-8 V* por cm (de distância entre os eletrodos), ou suas bandas irão literalmente rir da sua cara. *Procure descobrir a voltagem recomendada pelo fabricante do padrão de tamanho que você usa.
4. Bolhas ou partículas no gel ou nos poços também podem atrapalhar.

Se você tem tido outros problemas com eletroforese de DNA, como bandas pouco intensas, rastros, padrões de tamanho atípicos ou DNA que não sai do poço, dê uma olhada neste "troubleshooting". Ele explica muita coisa!

Será o fim de Sanger?

A genética avançou grandes passos no século XX. Foi somente na década de 1920 que foi demonstrado que o DNA é a molécula portadora da informação genética e, menos de 100 anos depois, é impressionante o quanto descobrimos sobre como esta informação é codificada, traduzida, transmitida e regulada.

Como já falei por aqui, um marco importante na história da genética foi a invenção do sequenciamento de DNA em 1977 – um método que levou o nome do seu inventor, Sanger. Mas o reinado absoluto de Sanger começou a ruir na década de 2000, quando surgiu a próxima geração de sequenciadores (Next Generation Sequencing, NGS), baseados em novos e diferentes princípios químicos, como pirosequenciamento, Solid, Illumina e, mais recentemente, Ion Torrent. A grande diferença está na velocidade e capacidade de sequenciamento, muito superiores a tecnologia anterior. O genoma humano que levou 13 anos para ser concluído com o método de Sanger, agora pode ser sequenciado em apenas um dia. Um salto e tanto, não? E quando o céu parecia ser o limite, uma 3ª geração de sequenciadores já começa a surgir no horizonte, com a promissora tecnologia dos nanoporos.

Parece óbvio que chegou a hora de o método de Sanger sair de linha e pendurar suas chuteiras. Os novos sequenciadores irão eventualmente liderar projetos grandes de sequenciamento de genomas e transcriptomas inteiros. É uma questão de dinheiro. O custo por base sequenciada é bem menor nos novos sequenciadores, mas em compensação eles são menos flexíveis quanto à quantidade de bases sequenciadas, ou você sequencia muitos pares de base de uma vez, ou você não sequencia nada. E por isso, acredito que o Sanger irá cada vez mais assumir um papel secundário, sendo utilizado para preencher gaps em genomas ou em projetos pequenos, como para confirmar construções ou a identidade de produtos de PCR.

Mas, por enquanto, o sequenciamento de Sanger ainda é considerado o “padrão ouro” em acurácia. E para realmente se consolidarem no mercado, o custo para a implementação e manutenção das plataformas de NGS precisa se tornar mais acessível e estas novas tecnologias ainda precisam de otimização e, principalmente, mais validação. O tamanho das sequências produzidas precisa aumentar, o que já vem acontecendo de maneira consistente, e também é preciso desenvolver algoritmos mais precisos para inferir a qualidade das leituras (o que varia conforme a técnica), e para montagem e manipulação da grande quantidade de dados produzida.

Chegamos ao ponto de produzir muito, mas muito mais dados do que somos capazes de processar e, principalmente, explorar. E, mais do que produzir sequenciadores mais velozes, agora é mais importante melhorarmos e validarmos os já existentes e, principalmente, pensarmos em como vamos manipular, interpretar e aplicar todos estes dados para transformá-los em informações úteis.

SHORT TIPS - Quando enzimas de restrição cortam onde não devem

Laboratório de biologia molecular que se preze tem pelo menos meia dúzia de enzimas de restrição no freezer. Elas cortam o DNA, não em pontos aleatórios, mas em sequências específicas, os sítios de restrição. Um grande número destas enzimas já foi identificado e está disponível comercialmente. Cada uma delas reconhece e corta um sítio de restrição diferente. E é justamente por isso que elas são tão úteis. Não importa qual seja a sua aplicação - cortar um plasmídio e/ou gene para clonagem ou a análise do padrão de fragmentos de um genoma – a especificidade destas enzimas é sempre essencial para o sucesso do experimento.

Mas, como nem tudo é perfeito, em algumas condições estas enzimas podem cortar o DNA onde não devem, ou seja, em sequências diferentes do seu sítio de restrição. O nome deste fenômeno é “atividade estrela” (star activity) e acontece quando a reação de digestão do DNA não segue as condições consideradas ótimas para o funcionamento da enzima. Em geral, você estará seguro se seguir o protocolo do fabricante, mas veja abaixo alguns cuidados para evitar este problema, principalmente, ao modificar o volume de reação.

Quantidade de enzima por reação.

Não deve ultrapassar 10% do volume final da reação. A enzima vem em uma solução que contem 50% de glicerol. E mais de 5% de glicerol na reação irá causar atividade estrela. Também é importante respeitar a quantidade de enzima (unidades) por quantidade (ug) de DNA recomendada pelo fabricante.

Tampão.

Use sempre o tampão recomendado, na diluição indicada. Em geral, cada enzima tem um tampão ótimo. E, a não ser que tenham composições iguais, o tampão de uma, não pode ser usado com outras enzimas.

Tempo de digestão.

Eu sei o quanto as incubações “overnight” (de um dia para o outro) são legais e práticas. Mas, por mais que o fabricante diga que a digestão pode levar de 2 a 18 horas, use sempre o tempo mínimo, ou algo mais próximo dele. Digestão longa demais pode resultar na perda de especificidade da enzima.

Contaminação da amostra.

Como já falei antes por aqui e aqui, RNA contaminado é sempre um problema para reações enzimáticas. E com DNA não é diferente. Tenha certeza que sua amostra está pura, sem vestígios de sais, álcool ou outros solventes orgânicos.

Referência:

http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/star_activity.asp#.T1t0szEgeQw