Troubleshooting - Sequenciamento de DNA

 Uma leitora, após várias tentativas de sequenciar alguns clones, me pediu algumas dicas sobre sequenciamento de DNA. Na minha experiência, as principais causas de problemas durante o sequenciamento estão relacionadas ao preparo das amostras. Vamos à discussão sobre algumas delas! O texto não é longo, mas se estiver com pressa, não deixe de olhar o checklist no final do post.

Purificação do DNA.

É muito importante utilizar um bom método de purificação de DNA, de preferência, um kit comercial adequado para esta aplicação. Purificar DNA com métodos “caseiros” pode funcionar, mas dificilmente vai remover todos os contaminantes que podem inibir a reação de sequenciamento. Uma maneira de verificar a presença de contaminantes em sua amostra purificada é determinar o seu espectro de absorbância. Como já falei por aqui, a razão entre as absorbâncias a 260/280 é um bom indicador de contaminação por proteínas, enquanto que a razão 260/230 é um bom indicador de contaminação por outros compostos orgânicos e por sais.

Para evitar contaminantes inibidores, deve-se usar água ultrapura para ressuspender ou eluir o DNA. Caso esteja usando um kit, verifique se o tampão de eluição não contém EDTA ou sais. O EDTA é um quelante de íons bivalentes e inibe a reação de sequenciamento ao sequestrar os íons de magnésio essenciais para a atividade da DNA polimerase.

Quantificação de DNA

Adicionar muito DNA pode inibir a reação, alterar a migração das amostras nos capilares ou mesmo bloqueá-los! Por mais que pareça pouco, adicione a quantidade de DNA recomendada pelos técnicos ou pelo kit de sequenciamento, que pode variar de acordo com o tipo de amostra (produto de PCR, DNA plasmidial, etc). No entanto, colocar menos DNA que o recomendado também não é bom e resultará em sinais de fluorescência muito baixos.

Para não errar por excesso e nem por escassez, é importante quantificar de forma precisa as amostras que serão sequenciadas. Se você tem poucas amostras, é fortemente recomendado a quantificação por eletroforese em gel de agarose. Aplique uma alíquota da sua amostra e em paralelo um fragmento de concentração conhecida e de tamanho próximo ao da sua amostra. Após a corrida, compare a intensidade das bandas por meio de um software de análise imagens como o ImageJ e estime a concentração da sua amostra com base na comparação entre as intensidades dos dois fragmentos. A maioria dos padrões de DNA indica em seus datasheets as quantidades relativas de pelo menos alguns dos seus fragmentos. Além de permitir a quantificação mais precisa do fragmento a ser sequenciado, através da eletroforese também é possível verificar se sua amostra não está degradada e detectar fragmentos contaminantes, como bandas de PCR não específicas, dímeros de primers, DNA genômico ou RNA, que condenariam o sequenciamento ao gerarem cromatogramas com picos sobrepostos.

Quantidade e integridade do primer

O primer é tão importante quanto a amostra. Adicione sempre a quantidade recomendada. Pouco primer também resultará em sinais de fluorescência baixos. A quantificação e a qualidade de purificação do primer dependem do fabricante, mas certifique-se que suas diluições estão corretas. Um dos possíveis problemas é o primer estar degradado. Para evitar a degradação guarde-os conforme o recomendado (-20ºC) e prepare alíquotas diluídas para reduzir os ciclos de descongelamento e congelamento da solução estoque. Nunca descongele seus primers aquecendo-os ou a temperatura ambiente, mas sempre em gelo. Em caso de suspeita de degradação, teste-os em um PCR com uma amostra controle, bem purificada.  

Especificidade do Primer

Se você está sequenciando um gene clonado em um vetor plasmidial, provavelmente, irá usar um primer já padronizado para este vetor. Se você desenhou primers específicos para o seu alvo, certifique-se que eles sejam específicos - que não se liguem em outras regiões do seu DNA template - e que não formem estruturas secundárias, como já discutido aqui.

Formação de estruturas secundárias no DNA alvo.

Isso pode ocorrer principalmente quando o DNA alvo é rico em GC. A formação dessas estruturas impede a incorporação de nucleotídeos e bloqueia o prosseguimento da reação de sequenciamento.

Recomendo a leitura deste site para aqueles que quiserem se aprofundar mais. Nele, são apontadas as causas para falhas específicas no sequenciamento.

Se tiver perguntes ou quiser sugerir a inclusão de mais algum ponto  esta lista, deixe um comentário.

Troubleshooting

Depois de muito tempo longe do blog, resolvi tirar a poeira inaugurando uma nova categoria de posts no RNAsefree: Troubleshooting.

Como recebo muitas perguntas por e-mail, frequentemente repetidas, achei que seria mais proveitoso publicar as perguntas e respostas no blog, pois a dúvida de um pode ser a mesma de muitos.

O nome "troubleshooting" faz referência ao tópico de solução de problemas que vem em todos os manuais de kits e reagentes de biologia molecular (e que todos deveriam ler, na maior parte das vezes são realmente úteis).

Deixem suas perguntas na forma de comentários ou escrevam para o e-mail: blog.rnase.free @ gmail. com

E suas dúvidas poderão dar origem a um post no blog!

Em breve, publicarei o primeiro post troubleshooting sobre preparo de amostras para sequenciamento de DNA pelo método de Sanger.

OBS.: Os nomes dos autores das perguntas assim como informações sobre seus projetos não serão publicados.

XI ECOTOX: Nanopartículas, proteínas e ecotoxicologia.

Quem me conhece ou lê o blog sabe que apesar da minha área ser a ecotoxicogenômica, eu vou bem mais para a “genômica” do que para a “ecotoxicologia”, pois meu trabalho atual e minha formação na graduação tem este viéis. Apesar disso, ou justamente por isso, eu tento ficar antenada também na ecotoxicologia e,  por isso, optei por apresentar meu trabalho no XI ECOTOX que, este ano, foi em Bombinhas, SC. O lugar é um paraíso na terra, apesar do clima estar frio, chuvoso e de parecer que a cidade inteira (incluindo comércio) ter saído de férias. Brincadeiras a parte, a cidade tem praias lindas, uma boa infra-estrutura hoteleira e certamente merece uma visita (no verão!).

Como minha intenção não é resumir aqui cada palestra que eu assisti, destaco as minhas impressões sobre os assuntos que mais chamaram minha atenção: a palestra e a mesa redonda sobre nanoresíduos e a palestra sobre proteômica aplicada a ecotoxicologia (é claro!).

A toxicologia de nanoresíduos é uma necessidade diante do crescente uso destes materiais (sim, já são muitos os produtos com nanotecnologia no mercado). A nanotecnologia vem se desenvolvendo bem mais rapidamente que os estudos acerca dos seus riscos para a saúde humana e para o meio ambiente. Como a demanda de informação é grande, imaginava que a toxicologia de nanopartículas fosse a “bola da vez” na área. No entanto, parece que globalmente estes não estão entre os projetos mais financiados. Talvez, porque milhões (ou bilhões?) tenham sido (e ainda são) investidos no desenvolvimento de nanotecnologias e tais estudos seriam um balde de água fria na área. Em todo o mundo, não há um único país que já tenha alguma regulamentação sobre o uso de nanopartículas e sem a realização de estudos toxicológicos não teremos as informações necessárias para regulamentar o seu uso. Mais uma vez, parece que vamos esperar os danos serem feitos, para depois fazer alguma coisa. Ainda assim, pelas palestras que assisti, pude ver que ainda que sejam poucos, os trabalhos na área são de qualidade e mostram resultados muito relevantes.

A palestra sobre proteômica aplicada na ecotoxicologia foi muito bacana, mostrou bem as perspectivas da área aprofundando-se na parte mais técnica na medida certa para o evento. Além da clássica comparação do perfil protéico (géis 2D) entre animais expostos e controle, foram apresentadas outras possibilidades, como subproteomas (de compartimentos subcelulares, secretomas, peptidomas, etc), detecção de proteínas com aductos específicos induzidos por xenobióticos e, o que mais me chamou a atenção, o ABPP (activity based protein profiling). Esta técnica permite detectar a atividade enzimática de diferentes enzimas simultaneamente através da utilização de substratos marcados. A atividade enzimática indica que de fato houve uma alteração no metabolismo celular e esta informação tem, portanto, maior relevância biológica que a detecção da indução de mRNA e da proteína, que não necessariamente se refletiriam em um aumento de atividade enzimática. Imaginem poder avaliar a atividade de todos os CYPs ou GSTs de um organismo simultaneamente? Uma técnica promissora!

Embora, já existam trabalhos com biomarcadores moleculares, espero ver no futuro trabalhos que lancem mão das “ômicas” na ecotoxicologia também aqui no Brasil e, certamente, esta palestra foi um bom incentivo. Também senti falta de palestras sobre outros poluentes emergentes além das nanopartículas, como compostos farmacêuticos presentes em efluentes domésticos. Fica a dica para a próxima!

ISMEE - Últimas vagas!

A Primeira Escola Internacional de Ecologia Marinha e Ecotoxicologia - que eu já divulguei por aqui - será no mês que vem! Mas se você perdeu o prazo de inscrição da primeira seleção, ainda dá tempo de se inscrever e conseguir uma das vagas extras que estão sendo oferecidas!

Para se inscrever, preencha o formulário no site do evento. Não se esqueça de anexar seu currículo e informar seu e-mail de contato.Lembrando que podem se inscrever alunos de pós-graduação de mestrado e doutorado.

Dúvidas devem ser encaminhadas para o e-mail do evento: ismee@bioletim.org

O cheiro do medo

Todos sabem que ratos têm medo de gatos. Quem nunca assistiu a um dos episódios de Tom & Jerry? Ao dar de cara com o Tom, o Jerry sempre dava no pé, pois ele sabia que aquele era o seu predador. Ele era a caça e o Tom, o caçador. Mas você sabia que mesmo ratos nascidos em laboratório, que nunca chegaram perto de um gato na vida, reagem com medo ao sentir o cheiro de um gato? Esta é uma reação inata, a presa já nasce com ela, o que lhe dá uma grande vantagem para fugir do seu predador. Talvez por isso o Tom nunca tenha conseguido pegar o Jerry!

Até pouco tempo atrás, não se sabia exatamente como isso acontecia. Seria realmente o cheiro do predador que gerava a reação de medo? Como as presas detectam este cheiro e o interpretam como perigo? Como a presa é capaz de detectar e identificar o cheiro de diferentes predadores?

Cientistas do Instituto de Pesquisa Scripps (EUA) e da UNICAMP (SP, Brasil) realizaram experimentos com camundongos para tentar responder a estas perguntas.

Primeiro, eles viram que o olfato é realmente importante para causar a reação de medo. Um órgão chamado vomeronasal, presente no nariz destes roedores, possui neurônios sensoriais responsáveis pelo olfato. Os camundongos que tinham um defeito neste órgão não reagiam com medo ao odor de predadores. Já os camundongos com um órgão vomeronasal perfeito, reagiam com medo e com um comportamento defensivo. Além disso, as regiões do seu cérebro responsáveis pelo olfato eram fortemente ativadas. A partir destas observações, os cientistas puderam concluir que o órgão vomeronasal é importante para o reconhecimento olfativo de predadores.

Em seguida, eles descobriram que a reações de medo e defesa são acionadas por proteínas específicas chamadas Mup, presentes na urina, na saliva, nos pêlos e na pele de muitos predadores, mas também na urina dos próprios camundongos. Os pesquisadores viram que as proteínas Mup de outros animais ativam neurônios diferentes no órgão vomeronasal e levantaram a hipótese de que existam neurônios especializados em reconhecer proteínas Mup de diferentes origens.

Através da ativação de neurônios específicos, seriam geradas respostas comportamentais distintas para cada tipo de estímulo. Por exemplo, a proteína Mup presente na urina de camundongos induz agressividade em outros camundongos machos – uma forma de marcarem seu território. No entanto, as proteínas Mup de predadores naturais como gatos, ratos e cobras, induzem o comportamento defensivo e de medo nos camundongos.

Todas estas observações confirmam que o comportamento observado em camundongos diante de predadores é inato. O sistema nervoso destes animais é geneticamente programado para detectar predadores e para reagir com um comportamento defensivo, ainda que nunca tenham se deparado com um predador na vida.

No final das contas, mesmo antes do primeiro encontro, o Jerry sempre esteve um passo a frente do Tom!

                                                           

Referência:

Papes, F.; Logan, D.W. & Stowers, L. 2010. The Vomeronasal Organ Mediates Interspecies Defensive Behaviors through Detection of Protein Pheromone Homologs. Cell: 141, 692–703, May 14, 2010. DOI 10.1016/j.cell.2010.03.037

Neste link, além do artigo e um resumo gráfico do trabalho, tem um vídeo onde os pesquisadores explicam o seu trabalho (em inglês).

Há tempos...

Já faz um bom tempo que não escrevo aqui no blog. Idéias não faltam, falta apenas passá-las para o papel :-) Neste meio tempo, junto com a Lia, comecei a idealizar um blog de divulgação científica, mas por "motivos de força maior", este projeto está temporariamente parado. Como eu já tenho um texto pronto - escrito para este novo blog - vou publicá-lo aqui antes que a notícia fique velha!

Aproveito para pedir a opinião crítica daqueles que lerem o texto cujo público alvo são adolescentes e jovens adultos não biólogos.

1st PRIMO International School on Marine Ecology and Ecotoxicology - ISMEE

De 17 a 31 de outubro de 2010 acontecerá em Arraial do Cabo, Rio de Janeiro,  a Primeira Escola Internacional de Ecologia Marinha e Ecotoxicologia. O público alvo são alunos de pós-graduação, preferencialmente doutorandos em seu primeiro ano de curso. 

Estão previstas atividades relacionadas a ecologia, biologia marinha, metodologia científica, história da ciência, desenho experimental, análise de dados entre outras.

A escola é uma iniciativa do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (UFRJ) e da Conferência PRIMO (Pollutant Responses in Marine Organisms).

Veja mais informações e como se inscrever no site do evento:

http://bioletim.biof.ufrj.br/ismee

Participem e divulguem!!!

O todo é mais que a soma das partes.

Impressões sobre o Systems Biology Meeting – Ouro Preto – MG – 2010.

 “A ciência sempre estudou as partes como meio de entender o todo. Mas nem sempre as partes se encaixam ou podem ser corretamente interpretadas quando isoladas. Quando olhamos para o todo, temos a perspectiva correta para colocar todas as peças no lugar e entender todas as conexões da complexa e dinâmica rede de moléculas que regem uma célula."

                                   (RNAse Free, “Eu vejo um novo começo de Era”, 29/01/2010)

A biologia de sistemas se sustenta sobre esta premissa. Seu objetivo: entender como uma célula ou um organismo funciona como um todo. Um organismo é um sistema complexo formado por componentes de diferentes propriedades e pelas conexões entre eles. 

Avanços tecnológicos recentes têm permitido que tenhamos uma visão mais global dos processos biológicos através de técnicas que produzem grandes quantidade e diversidade de dados.

O sistema e seus componentes.

Grande parte dos projetos ainda está concentrada na identificação dos componentes que constituem os sistemas biológicos: genoma, transcriptoma, proteoma, metaboloma, lipidoma, etc. Mesmo assim, ainda faltam muitas “peças” para sermos capazes de montar a “máquina” da vida.

Se não conhecemos todas as suas peças, não podemos entender como esta máquina funciona e nem criar modelos universais que a descrevam. E quanto mais genomas, transcriptomas e proteomas são seqüenciados, mais encontramos genes e proteínas desconhecidas, RNAs não codificantes – pequenos ou longos – de funções ainda desconhecidas. Peças que ainda não sabemos onde se encaixam e nem o que fazem.

As conexões do sistema.

Para montar esta máquina, além de conhecer suas partes, temos que entender como elas se relacionam, como se conectam. Conhecer as conexões entre os componentes de um sistema é essencial para entendermos como ele funciona.  E, pelo que vi neste encontro, este é atualmente um dos maiores desafios. Para superá-lo é imprescindível o desenvolvimento de ferramentas computacionais para manejar, interpretar e integrar a enorme quantidade de dados gerados por técnicas cada vez mais “high throughput”.

Mas muitos avanços já foram feitos. Ferramentas estão sendo desenvolvidas para integrar estes dados, gerar modelos matemáticos e montar redes de interação.

Como eu já falei aqui, a complexidade dos organismos está intrinsicamente relacionada a sua capacidade de regular seus componentes. E grande parte das “novas peças” -  RNAs não codificantes e sequências genômicas antes consideradas DNA “lixo” – estão aparentemente envolvidas em mecanismos de regulação gênica. Entender estes mecanismos de regulação é um passo importante para saber como todas as peças se encaixam para formar um sistema funcional.

O sistema a nosso favor: biologia sintética.

A biologia de sistemas busca integrar diferentes tipos de dados, achar a conexão entre eles para, por fim, criar modelos que permitam prever fenômenos biológicos, dados os componentes envolvidos. Embora isso ainda não seja exatamente uma realidade, esta história já tem um belo começo e começa a gerar frutos. Aplicações biotecnológicas para todo este conhecimento já começam a surgir.

Conhecendo as peças de uma máquina, como se encaixam e como juntas funcionam, podemos modificá-la ou, seguindo os seus princípios, criar uma máquina nova. E é isso que a biologia sintética se propõe a fazer: criar sistemas biológicos modificados para, por exemplo, produzir biocompostos, com maior eficiência. Fazer com que a máquina trabalhe a nosso favor.

O sistema é multidisciplinar

Ao final de cada palestra, havia sempre uma longa lista de pessoas envolvidas no projeto: professores, pós docs, doutorandos, mestrandos, alunos de graduação e colaboradores externos. A biologia de sistemas é a integração de várias disciplinas e seus projetos só podem ser executados através da colaboração entre profissionais com diferentes especialidades e mesmo entre instituições com infra-estruturas complementares, uma vez que muitos dos equipamentos necessários não são banais, mesmo para instituições acima da linha do equador.

Alguns palestrantes mostraram, inclusive, um fluxograma de etapas e pessoas, mostrando como todos estão conectados e como um depende dos dados do outro para realizar o seu trabalho.

Há quem veja a especialização do conhecimento com maus olhos, mas convenhamos que não há outro jeito. Estes projetos envolvem biologia molecular, celular, bioquímica, matemática, estatística e ciências computacionais em níveis avançados. Dificilmente, um único ser humano seria excepcional em todas estas áreas. Mas embora cada um faça sua parte, é importante que todos tenham um conhecimento mínimo de todas as etapas envolvidas e do projeto como um todo e, assim, não percam a perspectiva.

Achei muito legal ver trabalhos serem feitos totalmente em colaboração. Todos em um grupo de pesquisa, trabalhando dentro de um mesmo tema, por um mesmo projeto, para responder perguntas diferentes, mas dentro de uma questão maior. Até onde eu sei, isso não é tão comum aqui no Brasil. Geralmente, é cada aluno com o seu projeto. Por mais que estes projetos tenham alguma relação ou estejam dentro de um mesmo tema, não são tão interconectados e colaborativos assim. Penso em como poderíamos produzir trabalhos mais completos, se pensássemos e trabalhássemos mais em equipe!

Systems Biology Meeting - Ouro Preto, MG.

Entre 25 e 29 de abril estarei no Brasil Deutschland Systems Biology meeting, em Ouro Preto (MG).

A biologia de sistemas busca integrar dados heterogênos - derivados das muitas ômicas existentes hoje em dia - e, assim, construir uma visão sistêmica dos processos biológicos.

A programação está bastante interessante e conta com palestras sobre diferentes  bancos de dados e plataformas de biologia de sistemas, além de palestras sobre redes gênicas, microRNAs, biologia de sistemas do RNA e sobre o sequenciamento do transcriptoma de tumores através de uma abordagem ainda bastante recente chamada RNA-seq.

Na medida do possível, postarei atualizações sobre o evento durante a semana!

Aniversário: dois anos no ar!

Hoje, o RNAse Free completa dois aninhos no ar! E por uma coincidência bem legal é também a minha defesa de mestrado. Por esta razão, vou ficar devendo um post-científico-comemorativo. Mas é por boas razões :-)

Nos últimos 2 anos, compartilhei aqui muitas das coisas que aprendi, mas o blog também me serviu de incentivo para estudar e aprender coisas novas O que a princípio não me pareceu ser uma boa idéia, acabou me conquistando e, hoje, adoro postar!

Por mais que eu tente escrever também sobre coisas não relacionadas ao meu trabalho, eu não consigo fugir muito da biologia molecular e da genética. Não tem jeito: adoro! Depois destes 2 anos, me convenci que o blog é um espaço legal também para discutir algo tão específico. Por mais que não bata recordes de acesso, o blog é diariamente acessado  (média de 20/dia) e volta e meia faço novos contatos e troco idéias com outras pessoas da área.

Por isso, agora o RNAse Free está oficialmente vestindo a camisa da biologia molecular e genética (com pitadas de bioinformática para modernizar a coisa), agora que tenho pelo menos mais 4 longos anos nesta vida de bancada para encher o blog com posts sobre estes assuntos.

Mas além disso, eu quero este ano, FINALMENTE, tirar do papel a idéia de fazer um segundo blog, voltado para divulgação científica. Primeiro, porque eu gostaria de contribuir  com a divulgação da ciência produzida, principalmente, nas universidades brasileiras. Mas também porque, para escrever e manter um blog como este, eu vou ter que trabalhar muito a minha escrita e a minha capacidade de explicar as coisas de uma forma compreensível para pessoas-não-biólogas-moleculares (quase o mundo inteiro). E estas são habilidades que eu preciso melhorar! Vamos ver se desta vez sai! :-)

"Eu vejo um novo começo de era"

2010. Estamos fechando a primeira década do milênio. E para a biologia molecular, este começo foi muito bom: cada vez mais aumenta o número de variáveis avaliadas por experimento. Genomas e mais genomas inteiros são seqüenciados, experimentos com milhares de genes e proteínas são feitos. Ao invés de olhar para cada gene separadamente, agora, podemos ver como todos os genes de um organismo se comportam ao mesmo tempo. Estamos na era das ômicas.

A ciência sempre estudou as partes como meio de entender o todo. Mas nem sempre as partes se encaixam ou podem ser corretamente interpretadas quando isoladas. Quando olhamos para o todo, temos a perspectiva correta para colocar todas as peças no lugar e entender todas as conexões da complexa e dinâmica rede de moléculas que regem uma célula.

Mas para olhar para o todo e, de fato, enxergar tudo, ainda é preciso desenvolver meios melhores de manejar e, principalmente, integrar dados heterogêneos derivados do genoma, do transcriptoma, do proteoma, do metaboloma...

Parece um quebra-cabeça infinito!

Enquanto ainda estamos aprendendo a lidar com tanta informação, estão surgindo novas técnicas de sequenciamento de DNA que prometem impulsionar ainda mais este salto, das partes para o todo. Por 30 anos, o método de sequenciamento de DNA de Sanger é usado por toda a comunidade científica. Desde a sua publicação, em 1977, este método foi otimizado e automatizado ao ponto de permitir o sequenciamento de todo o genoma humano, concluído em 2003.

No entanto, em relação ao custo e principalmente a velocidade de produção de sequências, a “próxima geração de sequenciamento” deixa o método Sanger no chinelo. Para se ter uma idéia, em uma única corrida em um destes novos equipamentos, é possível produzir uma quantidade de sequências para a qual seriam necessárias 50 corridas em um equipamento pelo método de Sanger. Um pequeno genoma bacteriano poderia ser seqüenciado em uma única corrida. É um salto tecnológico sem precedentes!

É claro que nem tudo são flores, a maioria destas tecnologias produz sequências tão curtas quanto 20pb, mas outras já chegam a 400pb e, possivelmente, este número ainda deve aumentar. O maior desafio tem sido gerar ferramentas de bionformática para lidar com estes dados, mas esta corrida também já foi lançada.

Estas técnicas já estão sendo aplicadas a diferentes questões, em estudos metagenômicos, no sequenciamento de genomas e transcritptomas, como meio de inferir os níveis de expressão gênica em organismos sem qualquer sequência conhecida e mesmo para estudar o acúmulo de mutações em escala genômica ao longo das gerações de uma linhagem bacteriana. Novamente: é um salto tecnológico sem precedentes!

Para quem se interessar, recomendo a leitura destes dois artigos:

Stephan C Schuster. Next-generation sequencing transforms today's biology. Nature methods 5: 16-18 (2008). 

Metzker ML.Sequencing technologies — the next generation. Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46.

PCR: uma boa idéia!

A PCR (reação em cadeia da polimerase) sem dúvida foi uma invenção que revolucionou a biologia molecular ao permitir a síntese de DNA in vitro. Através desta técnica, é possível produzir bilhões de cópias de um segmento de DNA específico, a partir de uma única molécula! Pelo menos, em um mundo perfeito. Mais de duas décadas depois da sua invenção, já são muitas as variações e aplicações da PCR como no diagnóstico de doenças, na contagem de carga viral, na detecção de patógenos, em exames forenses e  como ferramenta em uma quase infinita lista de abordagens de pesquisa.

Kary B. Mullis foi o cara que inventou o PCR e por isso ganhou o prêmio nobel de química de 1993. Na época, ele trabalhava em uma empresa a quem vendeu sua idéia pela quantia irrisória de 10 mil dólares. A empresa vendeu a patente por 300 bilhões de dólares! Ou seja, Kary se deu mal, mas ganhou seu 1 milhão de dólares do prêmio Nobel e, hoje, ainda ganha muito dinheiro vendendo livros e dando palestras por aí.

Na verdade, há quem diga que Mullis somente incrementou o processo já descrito por H. Gobind Khorana e Kjell Kleppe, 17 anos antes, quando  conseguiram duplicar e, em seguida, quadruplicar uma pequena molécula de DNA sintético usando um par de primers e uma DNA polimerase. De qualquer forma, foi um "incremento" que fez toda diferença: usar a ciclagem de temperaturas e uma DNA polimerase resistente ao calor, uma vez que a cada ciclo é preciso aquecer o DNA a 94ºC para separar a dupla fita, o que tornava necessário adicionar mais DNA polimerase a cada ciclo.

Eis uma citação de Millis sobre como ele teve a idéia da PCR:

“Sometimes a good idea comes to you when you are not looking for it. Through an improbable combination of coincidences, naiveté and lucky mistakes, such a revelation came to me one Friday night in April, 1983, as I gripped the steering wheel of my car and snaked along a moonlit mountain road into northern California’s redwood country. That was how I stumbled across a process that could make unlimited numbers of copies of genes, a process now known as the polymerase chain reaction (PCR).”

Kary B. Mullis, Scientific American (1990) 262:36.

Eu não acredito em sorte, mas em mentes preparadas para enxergar uma nova idéia...alguns podem chamar de inspiração, mas acho que é um conjunto de fatores, não apenas conhecimento e inteligência, mas maturidade, desprendimento e persistência. É ter em mãos um punhado de coisas aparentemente inúteis e enxergar algo grande que se pode fazer com elas. E depois todos dizem, “como eu não tive esta idéia antes?”. As melhores idéias, quando expostas parecem muito simples, tão simples que ninguém nunca pensou antes! Para mim, a sofisticação está na simplicidade. Em diversos contextos. E por mais estranho que pareça, nem sempre é fácil encontrar a solução mais simples. Mas pode parecer mais inspirador ouvir que estas idéias surgem assim, como uma lâmpada que acende de repente por pura "sorte", como a "revelação" descrita por Mullis.

Anyway, obrigada Mullis! O que seria de nós sem o PCR....

Diário de uma mestranda: Perspectivas 2010

Entrando no clima de final de ano, pensei em fazer uma retrospectiva 2009 acadêmico-científica. Mas pensando bem, muita coisa seria repetição do que já escrevi aqui, outras seriam repetição de coisas sobre as quais já tenho exaustivamente pensado para desenvolver e escrever minha dissertação. Embora, academicamente, o meu ano não esteja terminando, acho que o momento é de olhar para frente e não para trás. Por isso, faço uma perspectiva 2010! Acho que a incapacidade de enxergar e entender as consequências é uma das principais coisas que nos levam a errar, em qualquer área: na ciência, na política, na vida. Por isso, é sempre bom nos planejarmos, pensarmos no depois, nas consequências. É claro que o dia primeiro de janeiro é apenas o dia seguinte do dia 31 de dezembro. Não há mágica nisso. O mundo e as pessoas continuarão sendo as mesmas. Mas não contamos o tempo á toa, aproveitemos, então, a virada de mais um ciclo para virar também velhas páginas e abrir novas...

Eu vou começar o ano fechando um ciclo de dois anos, o mestrado, e começando (assim espero) um outro ciclo, o doutorado. Entre janeiro e março, tenho que terminar de escrever minha dissertação, apresentar a prévia e a temida defesa, além de me preparar para a seleção de doutorado. Além de ser um momento tenso por si só, também é um momento que me faz pensar nas minhas escolhas. Seguir um doutorado é uma escolha importante, um compromisso de quatro anos e, em grande parte, um tiro no escuro. O que fazer depois do doutorado? Quais as possibilidades de emprego? Eu quero mesmo chegar aos 30 anos de idade como bolsista, sem 13º salário, sem assinaturas na carteira, ainda uma estudante, sem garantias de emprego, trabalhando horas extra sem receber nada a mais por isso? É claro que não era isso que eu sonhava estar fazendo aos 30 anos. Mas é o único caminho para quem quer ser cientista no Brasil. E como eu não me vejo fazendo outra coisa, é o caminho que eu vou seguir. 

A situação já foi muito pior, com bolsas menores e em menor número. Mas ainda assim, considerando-se que grande parte da pesquisa no Brasil acontece em instituições de ensino públicas, os pós-graduandos e pesquisadores brasileiros são ainda muito desvalorizados. E apesar das perspectivas não serem animadoras, sigo a minha intuição de continuar fazendo aquilo que gosto.

Apesar de tudo isso, ou melhor, devido a toda esta escassez de recursos, a concorrência para ingressar na pós graduação das melhores (e poucas) universidades é grande! Então, o ano já vai começar nesse clima, mais uma vez tendo que vencer a corrida para continuar nesse longo caminho...E depois será voltar ao trabalho no projeto de doutorado e projetos paralelos, começar a pensar e escrever o artigo do mestrado...pois depois de tudo isso a única coisa que contará para conseguir bolsas de pós doc, um emprego e mesmo verbas para pesquisa é o "número de artigos publicados"! Um índice nada cientifico para indicar quem é "melhor" que quem pelas agências de fomento e universidades.

Uma das coisas que eu pretendo correr atrás durante o meu doutorado é expandir meus horizontes na biologia. Isso mesmo. Não quero terminar o doutorado sabendo muito de quase nada. Uma tendência de quem faz doutorado. Aliás, uma tendência dos cursos de doutorado que, em geral, não oferecem oportunidades de expansão mas, sempre de especialização em uma área particular de conhecimento. E pretendo começar a fugir disso pelo blog, começando a escrever cada vez mais sobre coisas não relacionadas ao que eu faço no laboratório. Quem sabe,  nascerá um novo blog com um perfil diferente deste! (Pois a verdade, é que eu também gosto muito de discutir detalhes mínimos de biologia molecular que só interessam a outros biológos moleculares, assim, também gostaria de manter este blog como ele é atualmente)

Bom, mas para eu conseguir concluir minhas metas até março, vou ter que deixar o RNAse Free um pouco de lado, por enquanto...se eu resistir a escrever aqui de vez em quando. Embora os textos nunca fiquem como eu gostaria, escrever aqui é um exercício que eu gosto de fazer mas que toma alguma parte do meu tempo. Tempo que preciso gerenciar melhor nos próximos 3 meses.

Aos meus 3,5 leitores:

Boas festas! Um 2010 de sucesso, com muitas bolsas e verbas concedidas!

E podem continuar deixando comentários ou enviando e-mails.

Por que leveduras cometem suicídio?

Em organismos multicelulares, é comum a ocorrência do "suicídio celular", mais formalmente  conhecido como "morte celular programada" ou "apoptose". Trata-se de um processo controlado, um mecanismo que quando ativado, leva a célula a auto-destruição. Pode parecer loucura que nossas células cometam suicídio, mas são vários os contextos nos quais este "sacríficio" é necessário para o benefício do organismo como um todo. Através da apotose, células danificadas, velhas ou apenas que se tornaram desnecessárias são eliminadas do organismo. Por exemplo, as células do epitélio da pele estão sempre se renovando. Há uma camada basal de células que estão sempre se dividindo e dando origem a células novas para renovar o tecido e, em contrapartida, as células velhas, que estão no topo, entram em apoptose, ou seja, ativam o mecanismo de morte celular programada e...morrem. Assim, embora novas células estejam sempre sendo produzidas, o número total de células no tecido permanece constante.  Em equilíbrio. Outro exemplo muito bonito da dedicação das nossas células para com o bem estar do organismo como um todo é a apotose induzida pelos linfócitos T citotóxicos, um dos tipos celulares sanguíneos que cuidam da defesa do organismo. Quando ele encontra uma célula infectada por um vírus, ele faz com que ela se mate, impedindo que o vírus se reproduza e infecte outras células. A apoptose tem sido muito bem estudada e são muitos os outros contextos em que ela ocorre. Todos "justificados", as mortes não são em vão! 

Antes de eu trabalhar com moluscos, eu trabalhei com leveduras, fungos unicelulares que além de serem usados como fermento são muito estudados como um modelo "mínimo" de célula eucariótica. Um dia eu me deparei com um artigo que dizia que leveduras entram em apotose e não entendi nada, pois neste caso, o organismo é uma única célula. Quais razões justificariam um indvíduo cometer suicídio? Esta pergunta ficou na minha cabeça e tempos e tempos depois achei totalmente por acaso uma revisão que discutia as possíveis razões para a apoptose em leveduras e as implicações evolutivas que fazem com que  elas tenham uma boa razão pela qual morrer! 

 Morte em tempos de amor


Leveduras expostas a ferormônios (substâncias químicas que permitem que uma levedura reconheça outra para a reprodução sexuada) mas que não tenham achado um "parceiro" entram em apoptose. Isso sugere que a morte celular, neste caso, seja utilizada para eliminar células inférteis ou danificadas. Não reproduziu, "dançou". Isso que é seleção natural!

Morte em tempos de paz


Leveduras assim como muitos outros microrganismos podem formar comunidades chamadas "biofilmes". Por exemplo, um único esporo pode cair sobre uma fruta. Após muitas e muitas divisões celulares, todas as células  ali presentes terão se originado de uma mesma célula inicial e, portanto, constituem um mesmo "clone" que coloniza a fruta. Quando a quantidade de nutrientes começa a acabar (a fruta está chegando ao fim), as células mais velhas ou que já estão danificadas entram em apoptose para assim poupar nutrientes para as células mais jovens e que têm mais chances de sobreviver! Nesse caso, o "clone" é o que importa. E vale tudo, inclusive a morte de alguns indivíduos, para que ele continue a se propagar. Este "comportamento" está de acordo com a definição clássica de altruísmo: aumenta o fitness do grupo e diminui o do invidíduo altruísta.


Morte em tempos de guerra


Sim, as leveduras podem ser altruístas...mas também podem ser assassinas! Muitas leveduras carregam vírus que produzem toxinas para as quais são imunes. Assim, quando uma determinada linhagem "assassina" está colonizando uma fruta e uma mosca pousa na mesma trazendo células de uma linhagem diferente que não carrega consigo este vírus, a linhagem assassina irá liberar toxinas e, assim, eliminar a linhagem concorrente! Baixas doses destas toxinas induzem apoptose nas células de levedura suscetíveis...levando-as a morte.

Referência:

Buttner, S., Eisenberg, T., Herker, E., Carmona-Gutierrez, D., Kroemer, G., & Madeo, F. (2006). Why yeast cells can undergo apoptosis: death in times of peace, love, and war The Journal of Cell Biology, 175 (4), 521-525 DOI: 10.1083/jcb.200608098