6 de abril de 2008

Influência do pH na dosagem de ácidos nucléicos



A absorbância do RNA a 260 nm independe do pH da solução onde ele está dissolvido. Mas o mesmo não é verdade para alguns contaminantes que possivelmente podem estar presentes na solução de RNA!

Logo, embora a abs. a 260 nm permaneça a mesma, as leituras a 280 nm e 230 nm variam de acordo com o pH do meio. Por isso, analisando uma amostra de RNA em água ou soluções de pH relativamente ácido, pode-se obter razões 260/230 e 260/280 abaixo do normal sem que realmente haja tais contaminantes na amostra. O ideal é dosar o RNA em uma solução de pH levemente alcalino (7.5-8.5), como em tampão TE (pH 8.0).


Um exemplo prático


Já foram muitas as tentativas de extrair RNA da hemolinfa, quase sempre a partir da hemolinfa de apenas uma ostra e o resultado era sempre o mesmo: pouquíssimo RNA (praticamente nada) de baixíssima qualidade. No último experimento, resolvi fazer algumas modificações no protocolo:

1) Partir de um pool de hemolinfa de 4 ostras (aproximadamente, 9 mL) – onde foi muito importante a ajuda da Lia, que tira hemolinfa como ninguém (grazie! ou melhor, merci!).

2) Na etapa de precipitação:

- Além de isopropanol, adicionei 1/10 do volume de amostra de acetato de sódio (3 M), o que diminui ainda mais a solubilidade do RNA no álcool, aumentando a sua precipitação.

- Também adicionei 10 ug de glicogênio - um coprecipitante de ácidos nucléicos. O glicogênio não aumenta a precipitação do RNA, mas como ele também precipita nas mesmas condições, forma um pellet visível, o que facilita a manipulação da amostra (não sugar o RNA quando for retirar o sobrenadante!).

- Aumentei o tempo de incubação a -20ºC e da centrifugação (mas não a velocidade).


Como resultado, a quantidade de RNA obtido foi bem maior (~10 ug)! Mas as razões 260/230 e 260/280, embora tenham melhorado, ainda estavam longe do ideal.

Então, resolvi repetir a dosagem diluindo (10X) uma alíquota da amostra em tampão TE (pH 8.0) usando, obviamente, este tampão como branco. E, não é que ambas as razões e a curva do gráfico ficaram perfeitas ?!? Por isso que eu sempre digo, não há nada que o oráculo não saiba responder, basta saber perguntar!

Analisei a amostra (desnaturada em 60% de formamida, por 5 minutos a 65ºC) por eletroforese em gel de agarose 1.2% (em TAE 1X) e esta aí a imagem ao lado para comprovar.

No próximo post, eu explico o porquê de apenas uma banda, quando, comumente, se espera visualizar duas: uma da subunidade ribossomal maior e outra da menor. E não é por causa de degradação!

6 comentários:

Eliane, a Lia disse...

hey, essa das curvas perfeitas vc ñ tinha me contado! ou contou? e eu ñ lembro? bah fico felizzzzzz por vc!!!

Mauro Rebelo disse...

Ju... Você é o meu orgulho! Acho que eu vou aprender mais biologia molecular com você do que você comigo! Muito bom o texto.

Rafael Martins disse...

Olá, parabéns pela iniciativa! Seu blog é muito interessante, vou indicá-lo para meus colegas de Lab visitarem.

Juliana Americo disse...

Que bom que alguém lê meu blog!
Obrigada pelos comentários, pessoal :)

Anônimo disse...

Olá! Somos de um labs da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, e acabamos de descobrir seu blog. Muito legal!! Parabéns!!

Juliana Americo disse...

Obrigada, pessoal do RS! :)