Troubleshooting: o que fazer quando o RNA está com a razão 260nm/230nm baixa?

Leitor RNAse Free (por e-mail): "Meu RNA está com muito contaminante, pois a razão 260/230 está bem baixa. Tenho que obrigatoriamente fazer extração por Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, então gostaria de saber se você tem alguma dica de como melhorar a pureza do meu RNA e que não interfira nos microRNAs. Vi que você escreveu sobre um protocolo com cloreto de lítio, você chegou a testar? Funciona?”

Identificando o problema
A contaminação indicada pela razão 260/230 baixa pode ser causada por diferentes compostos. No caso do método do Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, podem ser traços destes compostos ou ainda de sal, álcool ou, dependendo do tecido de origem, polissacarídeos. Eu recomendo você ler suas amostras também a 270 nm e calcular a razão 260/270 que indica contaminação por fenol. Esta razão deve estar em torno de 1.2. Se estiver muito abaixo deste valor, então sua amostra está realmente contaminada com traços do reagente de extração (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio). Mas se não, é mais provável que sejam traços de sal, etanol ou polissacarídeos.


O que fazer?
Para evitar que sua amostra seja contaminada com o reagente de extração de RNA (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio), é preciso tomar muito cuidado na etapa de remoção do sobrenandante (a fase aquosa que contém o RNA e que se forma após a primeira etapa de centrifugação). É um pouco de prática. É preciso remover o sobrenandante sem se aproximar muito da interface. No entanto, é impossível remover todo o sobrenadante sem trazer um pouco de DNA genômico (a nuvem branca entre as fases orgânica e aquosa) e da fase orgânica (rosa, que fica na parte inferior do tubo). Então, nesta hora, é melhor perder um pouco de sobrenadante, mas ter certeza que todo o sobrenandante recolhido não está contaminado. 


Se você quiser tentar salvar suas amostras já contaminadas sugiro que você faça uma nova purificação com Fenol/Clorofórmio seguida de precipitação com etanol/acetato de sódio e lavagem com etanol 70%. Esta nova purificação com solvente orgânico irá remover os traços de fenol/clorofórmio. Mas, novamente, é preciso muito cuidado na remoção do sobrenadante.
Mas se suas amostras estiverem contaminadas com sal ou álcool basta fazer uma nova precipitação (adicionando 2.5 volumes de etanol absoluto e 1/10 volumes de acetato de sódio 3M) e em seguida lavando o pellet com etanol 70%. A maioria das pessoas tem pavor de vortexar os tubos nesta etapa de lavagem. Mas a não ser que seu pellet não seja visível, você deve vortexar gentilmente para lavar bem o pellet e remover o excesso de sais. Eu costumo fazer esta etapa pelo menos duas vezes.


Purificação com cloreto de lítio
Eu sempre faço a purificação com cloreto de lítio em todas as minhas amostras de RNA extraídas com Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio. Funciona mesmo. O RNA fica bem mais limpo e é essencial para amostras que possam estar contaminadas com polissacarídeos, como aquelas extraídas a partir de tecido muscular, por exemplo. No entanto, o cloreto de lítio não precipita de forma eficiente microRNAs. Então, não recomendo que você inclua esta etapa nas suas extrações, já que você tem interesse nesse tipo de RNA.


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Envie suas perguntas na forma de comentários ou por e-mail (blog.rnase.free @ gmail. com) e suas dúvidas poderão dar origem a um post na sessão "Troubleshooting" do RNAse Free.

Controle de qualidade de RNA - Opções “low cost”

Todo cuidado é pouco quando trabalhamos com RNA. Para se manipular este “ácido nucléico de uma fita só”, absolutamente tudo deve ser livre de RNAses, enzimas que estão por toda parte e que podem rapidamente degradar o nosso RNA de cada dia. Além disso, temperaturas elevadas e exposição à UV também podem degradar o RNA. Mas isso já foi discutido por aqui, logo no começo do blog (não é a toa que o nome deste blog é RNAse Free).

Se você quer isolar e identificar mRNAs completos ou quantificar níveis de mRNA por PCR quantitativa ou microarranjo de DNA, é essencial se certificar que a sua amostra de RNA esteja pura e íntegra. Um RNA contaminado pode afetar a eficiência de retrotranscrição. Um RNA ainda que apenas parcialmente degradado pode diminuir a precisão dos resultados ou mesmo arruinar o experimento.

É fácil reconhecer um RNA totalmente degradado através de eletroforese em gel de agarose (veja a amostra 1 na figura abaixo). Mas uma degradação parcial é mais difícil de identificar. Os RNAs 2 e 3 estão ambos íntegros? Com certeza? O RNA 3 parece íntegro para mim, mas o 2 me deixa na dúvida (Observação: o esperado para estas amostras é uma única banda de RNA ribossomal, pois trata-se de RNA total extraído de espécies de moluscos bivalves. Amostras de RNA obtidas de vertebrados, no entanto, devem exibir duas bandas de RNA ribossomal).

Como já falei por aqui, o Bioanalyzer é um equipamento que permite uma avaliação mais precisa da integridade do RNA através de eletroforese capilar. Mas ainda é bem caro e pouco comum nos laboratórios.

Então, como identificar uma degradação parcial de forma, digamos...mais econômica? Eis o “método” que chamo de “Bioanalyzer low cost”. Você deve fracionar sua amostra de RNA por eletroforese em gel de agarose em condições desnaturantes. Eu sigo o protocolo descrito por Masek et al (2005), pois é bem prático e efetivo. No entanto, no lugar do brometo de etídio, se possível, seria melhor usar algum corante mais sensível, como o SYBR Green II que detecta até 500 pg de RNA. A dica está em fazer uma análise densitométrica da imagem do gel usando um software de acesso livre como o Image J. Transformando o perfil eletroforético do RNA em um gráfico de densitometria é mais fácil identificar indícios de degradação parcial do RNA (ao menos para os meus olhos, que não são de águia).

É importante não aplicar RNA em excesso no gel e usar a mesma quantidade para todas as amostras. Usando brometo de etídio, eu não aplico mais de 800 ng (é possível usar ainda menos). Se você usar outro corante, mais sensível, use menos RNA ainda. RNA demais no gel pode resultar em um “rastro” que não necessariamente significa degradação.

E agora, olhando os gráficos ficou mais fácil decidir se amostra 2 tem sinais de degradação? O RNA íntegro (3), com uma única banda, resulta em um gráfico em formato de sino estreito, quanto maior a “barriga” do sino, maior o indício de degradação. Na amostra 1, esta “barriga” é bem grande, indicando seu alto grau de degradação. Na amostra 2, além do pico principal, observamos dois picos menores, indicando uma possível degradação parcial. 

Independente de analisar o perfil densitométrico da imagem ou não, é importante que a eletroforese tenha sido feita em condições desnaturantes, para evitar a formação de estruturas secundárias que no gel apareceriam como múltiplas bandas que poderiam ser confundidas com degradação. 

É claro que este "método" não é preciso e sensível como o bioanalyzer. É apenas uma dica para tornar a visualização de degradação mais clara e fácil!

Outro método acessível (baseado em PCR) para avaliar a integridade de amostras de RNA de forma mais acurada é a chamada razão 5’/3’. Mas este fica para o próximo post. Até lá! 

Troubleshooting - Sequenciamento de DNA

 Uma leitora, após várias tentativas de sequenciar alguns clones, me pediu algumas dicas sobre sequenciamento de DNA. Na minha experiência, as principais causas de problemas durante o sequenciamento estão relacionadas ao preparo das amostras. Vamos à discussão sobre algumas delas! O texto não é longo, mas se estiver com pressa, não deixe de olhar o checklist no final do post.

Purificação do DNA.

É muito importante utilizar um bom método de purificação de DNA, de preferência, um kit comercial adequado para esta aplicação. Purificar DNA com métodos “caseiros” pode funcionar, mas dificilmente vai remover todos os contaminantes que podem inibir a reação de sequenciamento. Uma maneira de verificar a presença de contaminantes em sua amostra purificada é determinar o seu espectro de absorbância. Como já falei por aqui, a razão entre as absorbâncias a 260/280 é um bom indicador de contaminação por proteínas, enquanto que a razão 260/230 é um bom indicador de contaminação por outros compostos orgânicos e por sais.

Para evitar contaminantes inibidores, deve-se usar água ultrapura para ressuspender ou eluir o DNA. Caso esteja usando um kit, verifique se o tampão de eluição não contém EDTA ou sais. O EDTA é um quelante de íons bivalentes e inibe a reação de sequenciamento ao sequestrar os íons de magnésio essenciais para a atividade da DNA polimerase.

Quantificação de DNA

Adicionar muito DNA pode inibir a reação, alterar a migração das amostras nos capilares ou mesmo bloqueá-los! Por mais que pareça pouco, adicione a quantidade de DNA recomendada pelos técnicos ou pelo kit de sequenciamento, que pode variar de acordo com o tipo de amostra (produto de PCR, DNA plasmidial, etc). No entanto, colocar menos DNA que o recomendado também não é bom e resultará em sinais de fluorescência muito baixos.

Para não errar por excesso e nem por escassez, é importante quantificar de forma precisa as amostras que serão sequenciadas. Se você tem poucas amostras, é fortemente recomendado a quantificação por eletroforese em gel de agarose. Aplique uma alíquota da sua amostra e em paralelo um fragmento de concentração conhecida e de tamanho próximo ao da sua amostra. Após a corrida, compare a intensidade das bandas por meio de um software de análise imagens como o ImageJ e estime a concentração da sua amostra com base na comparação entre as intensidades dos dois fragmentos. A maioria dos padrões de DNA indica em seus datasheets as quantidades relativas de pelo menos alguns dos seus fragmentos. Além de permitir a quantificação mais precisa do fragmento a ser sequenciado, através da eletroforese também é possível verificar se sua amostra não está degradada e detectar fragmentos contaminantes, como bandas de PCR não específicas, dímeros de primers, DNA genômico ou RNA, que condenariam o sequenciamento ao gerarem cromatogramas com picos sobrepostos.

Quantidade e integridade do primer

O primer é tão importante quanto a amostra. Adicione sempre a quantidade recomendada. Pouco primer também resultará em sinais de fluorescência baixos. A quantificação e a qualidade de purificação do primer dependem do fabricante, mas certifique-se que suas diluições estão corretas. Um dos possíveis problemas é o primer estar degradado. Para evitar a degradação guarde-os conforme o recomendado (-20ºC) e prepare alíquotas diluídas para reduzir os ciclos de descongelamento e congelamento da solução estoque. Nunca descongele seus primers aquecendo-os ou a temperatura ambiente, mas sempre em gelo. Em caso de suspeita de degradação, teste-os em um PCR com uma amostra controle, bem purificada.  

Especificidade do Primer

Se você está sequenciando um gene clonado em um vetor plasmidial, provavelmente, irá usar um primer já padronizado para este vetor. Se você desenhou primers específicos para o seu alvo, certifique-se que eles sejam específicos - que não se liguem em outras regiões do seu DNA template - e que não formem estruturas secundárias, como já discutido aqui.

Formação de estruturas secundárias no DNA alvo.

Isso pode ocorrer principalmente quando o DNA alvo é rico em GC. A formação dessas estruturas impede a incorporação de nucleotídeos e bloqueia o prosseguimento da reação de sequenciamento.

Recomendo a leitura deste site para aqueles que quiserem se aprofundar mais. Nele, são apontadas as causas para falhas específicas no sequenciamento.

Se tiver perguntes ou quiser sugerir a inclusão de mais algum ponto  esta lista, deixe um comentário.

Troubleshooting

Depois de muito tempo longe do blog, resolvi tirar a poeira inaugurando uma nova categoria de posts no RNAsefree: Troubleshooting.

Como recebo muitas perguntas por e-mail, frequentemente repetidas, achei que seria mais proveitoso publicar as perguntas e respostas no blog, pois a dúvida de um pode ser a mesma de muitos.

O nome "troubleshooting" faz referência ao tópico de solução de problemas que vem em todos os manuais de kits e reagentes de biologia molecular (e que todos deveriam ler, na maior parte das vezes são realmente úteis).

Deixem suas perguntas na forma de comentários ou escrevam para o e-mail: blog.rnase.free @ gmail. com

E suas dúvidas poderão dar origem a um post no blog!

Em breve, publicarei o primeiro post troubleshooting sobre preparo de amostras para sequenciamento de DNA pelo método de Sanger.

OBS.: Os nomes dos autores das perguntas assim como informações sobre seus projetos não serão publicados.

XI ECOTOX: Nanopartículas, proteínas e ecotoxicologia.

Quem me conhece ou lê o blog sabe que apesar da minha área ser a ecotoxicogenômica, eu vou bem mais para a “genômica” do que para a “ecotoxicologia”, pois meu trabalho atual e minha formação na graduação tem este viéis. Apesar disso, ou justamente por isso, eu tento ficar antenada também na ecotoxicologia e,  por isso, optei por apresentar meu trabalho no XI ECOTOX que, este ano, foi em Bombinhas, SC. O lugar é um paraíso na terra, apesar do clima estar frio, chuvoso e de parecer que a cidade inteira (incluindo comércio) ter saído de férias. Brincadeiras a parte, a cidade tem praias lindas, uma boa infra-estrutura hoteleira e certamente merece uma visita (no verão!).

Como minha intenção não é resumir aqui cada palestra que eu assisti, destaco as minhas impressões sobre os assuntos que mais chamaram minha atenção: a palestra e a mesa redonda sobre nanoresíduos e a palestra sobre proteômica aplicada a ecotoxicologia (é claro!).

A toxicologia de nanoresíduos é uma necessidade diante do crescente uso destes materiais (sim, já são muitos os produtos com nanotecnologia no mercado). A nanotecnologia vem se desenvolvendo bem mais rapidamente que os estudos acerca dos seus riscos para a saúde humana e para o meio ambiente. Como a demanda de informação é grande, imaginava que a toxicologia de nanopartículas fosse a “bola da vez” na área. No entanto, parece que globalmente estes não estão entre os projetos mais financiados. Talvez, porque milhões (ou bilhões?) tenham sido (e ainda são) investidos no desenvolvimento de nanotecnologias e tais estudos seriam um balde de água fria na área. Em todo o mundo, não há um único país que já tenha alguma regulamentação sobre o uso de nanopartículas e sem a realização de estudos toxicológicos não teremos as informações necessárias para regulamentar o seu uso. Mais uma vez, parece que vamos esperar os danos serem feitos, para depois fazer alguma coisa. Ainda assim, pelas palestras que assisti, pude ver que ainda que sejam poucos, os trabalhos na área são de qualidade e mostram resultados muito relevantes.

A palestra sobre proteômica aplicada na ecotoxicologia foi muito bacana, mostrou bem as perspectivas da área aprofundando-se na parte mais técnica na medida certa para o evento. Além da clássica comparação do perfil protéico (géis 2D) entre animais expostos e controle, foram apresentadas outras possibilidades, como subproteomas (de compartimentos subcelulares, secretomas, peptidomas, etc), detecção de proteínas com aductos específicos induzidos por xenobióticos e, o que mais me chamou a atenção, o ABPP (activity based protein profiling). Esta técnica permite detectar a atividade enzimática de diferentes enzimas simultaneamente através da utilização de substratos marcados. A atividade enzimática indica que de fato houve uma alteração no metabolismo celular e esta informação tem, portanto, maior relevância biológica que a detecção da indução de mRNA e da proteína, que não necessariamente se refletiriam em um aumento de atividade enzimática. Imaginem poder avaliar a atividade de todos os CYPs ou GSTs de um organismo simultaneamente? Uma técnica promissora!

Embora, já existam trabalhos com biomarcadores moleculares, espero ver no futuro trabalhos que lancem mão das “ômicas” na ecotoxicologia também aqui no Brasil e, certamente, esta palestra foi um bom incentivo. Também senti falta de palestras sobre outros poluentes emergentes além das nanopartículas, como compostos farmacêuticos presentes em efluentes domésticos. Fica a dica para a próxima!

ISMEE - Últimas vagas!

A Primeira Escola Internacional de Ecologia Marinha e Ecotoxicologia - que eu já divulguei por aqui - será no mês que vem! Mas se você perdeu o prazo de inscrição da primeira seleção, ainda dá tempo de se inscrever e conseguir uma das vagas extras que estão sendo oferecidas!

Para se inscrever, preencha o formulário no site do evento. Não se esqueça de anexar seu currículo e informar seu e-mail de contato.Lembrando que podem se inscrever alunos de pós-graduação de mestrado e doutorado.

Dúvidas devem ser encaminhadas para o e-mail do evento: ismee@bioletim.org

O cheiro do medo

Todos sabem que ratos têm medo de gatos. Quem nunca assistiu a um dos episódios de Tom & Jerry? Ao dar de cara com o Tom, o Jerry sempre dava no pé, pois ele sabia que aquele era o seu predador. Ele era a caça e o Tom, o caçador. Mas você sabia que mesmo ratos nascidos em laboratório, que nunca chegaram perto de um gato na vida, reagem com medo ao sentir o cheiro de um gato? Esta é uma reação inata, a presa já nasce com ela, o que lhe dá uma grande vantagem para fugir do seu predador. Talvez por isso o Tom nunca tenha conseguido pegar o Jerry!

Até pouco tempo atrás, não se sabia exatamente como isso acontecia. Seria realmente o cheiro do predador que gerava a reação de medo? Como as presas detectam este cheiro e o interpretam como perigo? Como a presa é capaz de detectar e identificar o cheiro de diferentes predadores?

Cientistas do Instituto de Pesquisa Scripps (EUA) e da UNICAMP (SP, Brasil) realizaram experimentos com camundongos para tentar responder a estas perguntas.

Primeiro, eles viram que o olfato é realmente importante para causar a reação de medo. Um órgão chamado vomeronasal, presente no nariz destes roedores, possui neurônios sensoriais responsáveis pelo olfato. Os camundongos que tinham um defeito neste órgão não reagiam com medo ao odor de predadores. Já os camundongos com um órgão vomeronasal perfeito, reagiam com medo e com um comportamento defensivo. Além disso, as regiões do seu cérebro responsáveis pelo olfato eram fortemente ativadas. A partir destas observações, os cientistas puderam concluir que o órgão vomeronasal é importante para o reconhecimento olfativo de predadores.

Em seguida, eles descobriram que a reações de medo e defesa são acionadas por proteínas específicas chamadas Mup, presentes na urina, na saliva, nos pêlos e na pele de muitos predadores, mas também na urina dos próprios camundongos. Os pesquisadores viram que as proteínas Mup de outros animais ativam neurônios diferentes no órgão vomeronasal e levantaram a hipótese de que existam neurônios especializados em reconhecer proteínas Mup de diferentes origens.

Através da ativação de neurônios específicos, seriam geradas respostas comportamentais distintas para cada tipo de estímulo. Por exemplo, a proteína Mup presente na urina de camundongos induz agressividade em outros camundongos machos – uma forma de marcarem seu território. No entanto, as proteínas Mup de predadores naturais como gatos, ratos e cobras, induzem o comportamento defensivo e de medo nos camundongos.

Todas estas observações confirmam que o comportamento observado em camundongos diante de predadores é inato. O sistema nervoso destes animais é geneticamente programado para detectar predadores e para reagir com um comportamento defensivo, ainda que nunca tenham se deparado com um predador na vida.

No final das contas, mesmo antes do primeiro encontro, o Jerry sempre esteve um passo a frente do Tom!

                                                           

Referência:

Papes, F.; Logan, D.W. & Stowers, L. 2010. The Vomeronasal Organ Mediates Interspecies Defensive Behaviors through Detection of Protein Pheromone Homologs. Cell: 141, 692–703, May 14, 2010. DOI 10.1016/j.cell.2010.03.037

Neste link, além do artigo e um resumo gráfico do trabalho, tem um vídeo onde os pesquisadores explicam o seu trabalho (em inglês).

Há tempos...

Já faz um bom tempo que não escrevo aqui no blog. Idéias não faltam, falta apenas passá-las para o papel :-) Neste meio tempo, junto com a Lia, comecei a idealizar um blog de divulgação científica, mas por "motivos de força maior", este projeto está temporariamente parado. Como eu já tenho um texto pronto - escrito para este novo blog - vou publicá-lo aqui antes que a notícia fique velha!

Aproveito para pedir a opinião crítica daqueles que lerem o texto cujo público alvo são adolescentes e jovens adultos não biólogos.

1st PRIMO International School on Marine Ecology and Ecotoxicology - ISMEE

De 17 a 31 de outubro de 2010 acontecerá em Arraial do Cabo, Rio de Janeiro,  a Primeira Escola Internacional de Ecologia Marinha e Ecotoxicologia. O público alvo são alunos de pós-graduação, preferencialmente doutorandos em seu primeiro ano de curso. 

Estão previstas atividades relacionadas a ecologia, biologia marinha, metodologia científica, história da ciência, desenho experimental, análise de dados entre outras.

A escola é uma iniciativa do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (UFRJ) e da Conferência PRIMO (Pollutant Responses in Marine Organisms).

Veja mais informações e como se inscrever no site do evento:

http://bioletim.biof.ufrj.br/ismee

Participem e divulguem!!!