18 de agosto de 2011

Controle de qualidade de RNA - Opções “low cost”

Todo cuidado é pouco quando trabalhamos com RNA. Para se manipular este “ácido nucléico de uma fita só”, absolutamente tudo deve ser livre de RNAses, enzimas que estão por toda parte e que podem rapidamente degradar o nosso RNA de cada dia. Além disso, temperaturas elevadas e exposição à UV também podem degradar o RNA. Mas isso já foi discutido por aqui, logo no começo do blog (não é a toa que o nome deste blog é RNAse Free).
Se você quer isolar e identificar mRNAs completos ou quantificar níveis de mRNA por PCR quantitativa ou microarranjo de DNA, é essencial se certificar que a sua amostra de RNA esteja pura e íntegra. Um RNA contaminado pode afetar a eficiência de retrotranscrição. Um RNA ainda que apenas parcialmente degradado pode diminuir a precisão dos resultados ou mesmo arruinar o experimento.
É fácil reconhecer um RNA totalmente degradado através de eletroforese em gel de agarose (veja a amostra 1 na figura abaixo). Mas uma degradação parcial é mais difícil de identificar. Os RNAs 2 e 3 estão ambos íntegros? Com certeza? O RNA 3 parece íntegro para mim, mas o 2 me deixa na dúvida (Observação: o esperado para estas amostras é uma única banda de RNA ribossomal, pois trata-se de RNA total extraído de espécies de moluscos bivalves. Amostras de RNA obtidas de vertebrados, no entanto, devem exibir duas bandas de RNA ribossomal).

Como já falei por aqui, o Bioanalyzer é um equipamento que permite uma avaliação mais precisa da integridade do RNA através de eletroforese capilar. Mas ainda é bem caro e pouco comum nos laboratórios.
Então, como identificar uma degradação parcial de forma, digamos...mais econômica? Eis o “método” que chamo de “Bioanalyzer low cost”. Você deve fracionar sua amostra de RNA por eletroforese em gel de agarose em condições desnaturantes. Eu sigo o protocolo descrito por Masek et al (2005), pois é bem prático e efetivo. No entanto, no lugar do brometo de etídio, se possível, seria melhor usar algum corante mais sensível, como o SYBR Green II que detecta até 500 pg de RNA. A dica está em fazer uma análise densitométrica da imagem do gel usando um software de acesso livre como o Image J. Transformando o perfil eletroforético do RNA em um gráfico de densitometria é mais fácil identificar indícios de degradação parcial do RNA (ao menos para os meus olhos, que não são de águia).
É importante não aplicar RNA em excesso no gel e usar a mesma quantidade para todas as amostras. Usando brometo de etídio, eu não aplico mais de 800 ng (é possível usar ainda menos). Se você usar outro corante, mais sensível, use menos RNA ainda. RNA demais no gel pode resultar em um “rastro” que não necessariamente significa degradação.



E agora, olhando os gráficos ficou mais fácil decidir se amostra 2 tem sinais de degradação? O RNA íntegro (3), com uma única banda, resulta em um gráfico em formato de sino estreito, quanto maior a “barriga” do sino, maior o indício de degradação. Na amostra 1, esta “barriga” é bem grande, indicando seu alto grau de degradação. Na amostra 2, além do pico principal, observamos dois picos menores, indicando uma possível degradação parcial. 
Independente de analisar o perfil densitométrico da imagem ou não, é importante que a eletroforese tenha sido feita em condições desnaturantes, para evitar a formação de estruturas secundárias que no gel apareceriam como múltiplas bandas que poderiam ser confundidas com degradação. 
É claro que este "método" não é preciso e sensível como o bioanalyzer. É apenas uma dica para tornar a visualização de degradação mais clara e fácil!
Outro método acessível (baseado em PCR) para avaliar a integridade de amostras de RNA de forma mais acurada é a chamada razão 5’/3’. Mas este fica para o próximo post. Até lá! 

7 comentários:

Alexandre Magno disse...

Dica fantástica, nunca tinha pensado nisso! E olha que uso o Image J semanalmente, mas para blot.

Virgínia disse...

Muito legal o seu blog.. me ajudou muito numa duvida que tinha.. eu achei por acaso quando fazia uma busca pelo google.. Parabéns.

Juliana Americo disse...

Obrigada pelos comentários, Virgínia e Alexandre! Voltem sempre :-)
Abs
Juliana

Anônimo disse...

Parabéns pelo blog. Muito legal e muuuuuuuito últil. Porém, tenho uma dúvida: vc saberia me dizer se na extração de microRNA dá pra ver a integridade desses RNAs por gel?

Obrigado.

Att.
Alexandre

Juliana Americo disse...

Olá, obrigada pela visita!
Eu nunca trabalhei com micro RNA, mas acredito que não seja possível o checar sua integridade em gel, a não ser em um gel de alta resolução. Acredito que a melhor abordagem seria usar um sistema de eletroforese capilar (bioanalyzer).
Desculpe a resposta tardia!
Um abraço
Juliana

Mai disse...

Quais seriam essas condições desnaturantes? Algum reagente que coloca no tampão de eletroforese?

Juliana Americo disse...

Sim, formamida que vai no tampão de amostra como descrito no artigo de Masek que cito no post: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15582557